小麥細(xì)胞分裂素受體基因TaHK1的生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析

孫麗靜，趙 慧，呂亮杰，張穎君，胡夢蕓，劉 茜，李 輝

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

細(xì)胞分裂素是一類重要的植物激素，在細(xì)胞分裂、調(diào)控頂端優(yōu)勢、促進(jìn)芽的分化、抑制主根伸長、葉綠素合成、延緩葉片衰老、種子發(fā)育、打破種子休眠、抵御鹽和干旱等非生物脅迫及病原菌抵抗等過程中發(fā)揮了重要作用[1-8]。

植物細(xì)胞分裂素受體屬于組氨酸蛋白激酶家族，擬南芥中有3個(gè)細(xì)胞分裂素受體，分別為AHK2、AHK3和CRE1(又名AHK4或WOL1)[9]。在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)過表達(dá)這3個(gè)受體中的任何一個(gè)都能夠增加對細(xì)胞分裂素的敏感性[10]。細(xì)胞分裂素3個(gè)受體基因的單突變體對外源細(xì)胞分裂素的敏感性有不同程度的降低，雙突變體對外源細(xì)胞分裂素的敏感性進(jìn)一步降低，但除ahk2ahk3外，其余單突變體和雙突變體在正常生長條件下均無明顯表型[11-12]。然而，ahk2ahk3ahk4三重突變體對外源細(xì)胞分裂素不敏感且存在嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，如地上部分和根部的嚴(yán)重縮小、側(cè)根數(shù)目減少、維管組織分化缺陷、葉片衰老加速、種子增大等[11, 13]，暗示細(xì)胞分裂素受體參與了植株正常生長發(fā)育的許多方面，并且存在一定的功能疊加。此外，AHK2、AHK3和AHK4受干旱誘導(dǎo)表達(dá)，ahk2和ahk3單突變體以及ahk2ahk3雙突變體對干旱的抗性增加；表達(dá)譜分析顯示，ahk2ahk3雙突變體中，大量脅迫和ABA誘導(dǎo)的基因表達(dá)量升高，表明AHK2和AHK3是干旱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)節(jié)因子。另外，ahk2、ahk3和cre1單突變體對外源ABA超敏感，表明AHK2、AHK3和CRE1同樣是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子[14]。

本研究以擬南芥細(xì)胞分裂素受體基因AHK4氨基酸序列為參考序列，同源克隆小麥細(xì)胞分裂素受體基因TaHK1，并利用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測該基因的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、定位、功能結(jié)構(gòu)域和表達(dá)規(guī)律等，為今后克隆該基因并開展功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用擬南芥細(xì)胞分裂素受體基因AHK4(At2g01830)氨基酸序列比對EnsemblPlants小麥數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org)，得到與其相似度最高的基因序列，以及該基因的基本信息(包括基因長度和外顯子、內(nèi)含子數(shù)目等)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1TaHK1的生物信息學(xué)分析 目的基因的生物信息學(xué)分析主要參照高嵩等[15]的方法。具體如下：目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)通過ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測；目的基因編碼蛋白的疏水性通過軟件ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線分析,目的基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)通過NPS@:SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線預(yù)測；目的基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位通過TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)和iPSORT(http://ipsort.hgc.jp/)在線預(yù)測；通過SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測目的基因編碼蛋白的信號肽；通過TMHMM Server, v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測目的基因編碼蛋白的跨膜域；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線預(yù)測；蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)通過NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線預(yù)測；目的基因的表達(dá)量通過Wheat Expression Browser(http://www.wheat-expression.com/)在線分析。

1.2.2 植物總RNA的提取及cDAN合成 利用TRNzol Reagent(TIANGEN)提取植物總RNA。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 利用Primer Express軟件對目標(biāo)基因進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)。上游引物TaHK1-QF：5′-AATGGCACTTCGCTAACCAG-3′，下游引物TaHK1-QR：5′-TTCACACCCGTTCTGTTTCA-3′。以小麥TaActin為內(nèi)參，用SYBR?Premix ExTaq Ⅱ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，TaActin引物序列、擴(kuò)增體系和程序參照孫麗靜等[16]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaHK1序列的獲得

以擬南芥AHK4(At2g01830)為參考序列，在EnsemblPlants小麥數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對，得到同源性最高的基因TRIAE_CS42_4DS_TGACv1_362760 _AA1181940(EnsemblPlants)，位于小麥4D染色體上，命名為TaHK1。TaHK1基因組DNA序列全長7 190 bp，包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子(圖1)。TaHK1cDNA全長3 747 bp，包含一個(gè)2 991 bp的開放閱讀框，編碼996個(gè)氨基酸。

矩形.外顯子；折線.內(nèi)含子。Rectangle.Exon; Broken line. Intron.

2.2 蛋白理化性質(zhì)分析

通過ExPASy-ProtParam[17]預(yù)測TaHK1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。該蛋白的分子質(zhì)量為109.70 ku，理論等電點(diǎn)為5.71；-0.148的親水性平均系數(shù)表明該蛋白為親水性蛋白(表1)。通過ExPASy網(wǎng)站提供的ProtScale工具進(jìn)一步分析TaHK1基因編碼蛋白的疏水性，峰值分布在0以下的氨基酸(56.48%)比分布在0以上的氨基酸(43.52%)多，同樣表明該蛋白為親水性蛋白(圖2)。氨基酸組成及含量分析顯示，TaHK1中含量最高的為Leu，占整體的10.2%(圖3)。

表1 TaHK1蛋白理化性質(zhì)分析Tab.1 Physical and chemical property analysis of TaHK1

圖2 TaHK1蛋白疏水性預(yù)測Fig.2 Prediction of the TaHK1 protein hydrophobicity

2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過NPS@:SOPMA[18]分析TaHK1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TaHK1蛋白中α-螺旋(Hh)比例最高，占比47.89%；之后依次為無規(guī)則卷曲(Cc)、延伸鏈(Ee)和β-轉(zhuǎn)角(Tt)，占比分別為35.04%，12.95%和4.12%(圖4)。

2.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測

了解基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位有助于了解該基因的功能。通過TargetP[19]預(yù)測TaHK1蛋白的分布位置，發(fā)現(xiàn)其位于葉綠體、線粒體和分泌到細(xì)胞外的可能性很小，位于其他細(xì)胞器的可能性較大(表2)。

通過WoLF PSORT在線預(yù)測TaHK1蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜定位系數(shù)為8(plas:8)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位系數(shù)為3(E.R.:3)，細(xì)胞核定位系數(shù)為1(nucl:1)，細(xì)胞質(zhì)定位系數(shù)為1(cyto:1)，液泡定位系數(shù)為1(vacu:1)。綜上推測，TaHK1定位于細(xì)胞膜的可能性較大，這與其作為細(xì)胞分裂素受體接受來自細(xì)胞外的信號并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的功能是一致的。

圖3 TaHK1氨基酸組成及含量分析Fig.3 Amino acid composition and content in TaHK1

圖4 TaHK1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of TaHK1

項(xiàng)目長度葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽線粒體靶向肽分泌通路信號肽其他位置可靠性等級ItemLengthcTPmTPSPOtherLocRCTaHK1蛋白TaHK1 protein9960.0680.0600.0250.973-1中斷Cutoff0.0000.0000.0000.000

2.5 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測

通過SignalP[20]對TaHK1蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TaHK1蛋白沒有信號肽(圖5)。iPSORT[21]預(yù)測結(jié)果同樣表明，TaHK1蛋白沒有信號肽，并且也不含線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，與SignalP預(yù)測結(jié)果一致。

2.6 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過TMHMM[22]對TaHK1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，與擬南芥AHK4相同，TaHK1也有2個(gè)跨膜域，分別位于第34-53位氨基酸和326-348位氨基酸(圖6)，與WoLF PSORT預(yù)測的其細(xì)胞膜定位結(jié)果一致。

圖5 TaHK1信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide prediction of TaHK1

A.小麥TaHK1；B.擬南芥AHK4.A. TaHK1 of wheat；B. AHK4 of Arabidopsis.

2.7 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過SMART在線軟件[23]分析TaHK1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，TaHK1第34-53位氨基酸和第326-348位氨基酸為2個(gè)跨膜域(Transmembrane region)，與TMHMM分析結(jié)果一致；第106-290位氨基酸為CHASE(Cyclaseand histidine kinase-associated sensing extracellular)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)受體與細(xì)胞分裂素的結(jié)合；第378-443位氨基酸為組氨酸激酶(His kinase A domain)結(jié)構(gòu)域；第490-671位氨基酸為類組氨酸激酶ATP酶(Histidine kinase-like ATPases)結(jié)構(gòu)域；第851-986位氨基酸為REC(cheY-homologous receiver domain)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)接受來自激酶域的磷酸基團(tuán)，并向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白傳遞(圖7)。

2.8 磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。通過NetPhos[24]對TaHK1蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TaHK1共有87個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)最多，為56個(gè)；其次為蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)，分別為25，6個(gè)(圖8)。

圖7 TaHK1保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.7 Conserved domain prediction of TaHK1

圖8 TaHK1磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.8 The phosphorylation sites prediction of TaHK1

2.9 TaHK1基因的表達(dá)特性分析

為了更好的了解TaHK1的功能，通過Wheat Expression Browser在線分析TaHK1基因在不同組織的表達(dá)模式[25]。結(jié)果顯示，TaHK1在根、莖、葉、雄蕊和小穗中的表達(dá)量較高，而在籽粒的糊粉層、淀粉性胚乳和種皮等組織的表達(dá)量較低(圖9)，暗示該基因可能在小麥生長發(fā)育的很多階段和組織均發(fā)揮著一定作用。

圖9 TaHK1在小麥不同組織中的表達(dá)分析Fig.9 Relative expression of TaHK1 in different tissues of wheat

此外，分析結(jié)果顯示，TaHK1基因?qū)γ{迫處理和病原菌接種也有一定的響應(yīng)。TaHK1表達(dá)量在低磷脅迫、接種葉枯病菌4 d、接種條銹病菌48 h和72 h、接種白粉病菌72 h明顯升高；而在干旱脅迫6 h，TaHK1表達(dá)量則顯著降低(圖10)。以上結(jié)果表明，TaHK1在小麥抵御病原菌侵染和干旱脅迫的過程中也發(fā)揮著重要作用。

圖10 TaHK1在脅迫處理和病原菌侵染下的相對表達(dá)量Fig.10 Relative expression of TaHK1 under stress and disease treatments

2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TaHK1基因在小麥科農(nóng)199不同組織的表達(dá)特性

為了進(jìn)一步了解TaHK1基因在小麥科農(nóng)199不同組織的表達(dá)特性，為其功能研究奠定基礎(chǔ)，本研究提取科農(nóng)199不同組織RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對TaHK1基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，TaHK1在幼葉中表達(dá)量最高，其次是穗部，而幼根、旗葉等其他組織中表達(dá)量較低，在成熟根中的表達(dá)量最低(圖11)。

圖柱上不同字母表示組織間在0.05水平上差異顯著。Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

3 結(jié)論與討論

TaHK1是小麥中的細(xì)胞分裂素受體基因，研究其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能將為小麥中細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TaHK1蛋白由996個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為109.70 ku，理論等電點(diǎn)為5.71；TaHK1蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角4種構(gòu)象組成；通過亞細(xì)胞定位預(yù)測，TaHK1定位于細(xì)胞膜的可能性較大，并且跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其具有2個(gè)跨膜域；蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，TaHK1具有典型的細(xì)胞分裂素受體的完整結(jié)構(gòu)域，包括結(jié)合細(xì)胞分裂素的CHASE結(jié)構(gòu)域、跨膜域、組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)磷酸傳遞的REC結(jié)構(gòu)域，并且含有87個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測其在細(xì)胞分裂素細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。

細(xì)胞分裂素在植物發(fā)育[26-28]和應(yīng)對鹽漬、干旱等非生物脅迫[29-31]的過程中均扮演著重要的角色。擬南芥中AHK2、AHK3和AHK4在根、莖、葉等各個(gè)組織均有廣泛表達(dá)，能夠很好地解釋其三重突變體地上部分和根部的嚴(yán)重縮小、側(cè)根數(shù)目減少、葉片衰老加速、種子增大等生長發(fā)育缺陷表型[12]。水稻中OsHK6(OsCKT1)也在根、莖、葉、幼穗等組織廣泛表達(dá)[32]。與擬南芥和水稻中的同源基因類似，TaHK1在根、莖、葉、雄蕊和小穗等各個(gè)組織也有廣泛表達(dá)，推測其在小麥生長發(fā)育的很多階段和組織均發(fā)揮著一定作用。但是實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果與Wheat Expression Browser在線分析TaHK1基因在不同組織的表達(dá)模式有一定的差異，推測其原因?yàn)橥ㄟ^網(wǎng)站在線分析為綜合多個(gè)小麥品種多個(gè)時(shí)期的試驗(yàn)結(jié)果，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果為特定小麥品種科農(nóng)199中TaHK1基因的組織表達(dá)模式。另外，擬南芥中AHK2、AHK3和AHK4表達(dá)量受干旱誘導(dǎo)迅速上調(diào)，表型分析顯示，ahk2和ahk3單突變體及ahk2ahk3雙突變體對干旱脅迫抗性增強(qiáng)[14]。相反，TaHK1表達(dá)量則受干旱脅迫抑制下調(diào)，推測其在小麥干旱脅迫中的功能可能與擬南芥中的同源基因不同。此外，TaHK1表達(dá)量還受低磷脅迫和多種病原菌侵染誘導(dǎo)，暗示其在小麥營養(yǎng)吸收和抵御病原菌侵染過程中可能也發(fā)揮著重要作用。

為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，本研究中的大量數(shù)據(jù)使用了多種軟件進(jìn)行分析，并且預(yù)測結(jié)果基本一致，具有較高的可信度。但是，生物信息學(xué)是基于已知信息進(jìn)行的預(yù)測，所以具有一定的局限性。因此，TaHK1編碼蛋白的性質(zhì)和生物學(xué)功能還需要分子生物學(xué)和生物化學(xué)等試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為TaHK1的克隆提供了一定的理論依據(jù)，也為后續(xù)基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。