草莓生長素響應(yīng)基因FvIAA17的克隆及表達(dá)分析

蘇麗艷

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,秦嶺野生觀賞植物研究中心, 陜西 西安 710065)

草莓(FragariaananassaDuch.)因味道鮮美，富含大量的維生素而廣受歡迎。近年來我國草莓種植面積不斷增長，栽植草莓具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益，然而草莓畸形果的形成直接影響草莓商品價(jià)值。果實(shí)發(fā)育受到生長素(Auxin)、脫落酸(ABA)、乙烯(Ethylene)、赤霉素(GA)等多種植物激素的共同調(diào)控，草莓作為呼吸非躍變型果實(shí)的典型代表，其發(fā)育及成熟過程主要受到生長素和脫落酸的調(diào)控[1]，激素之間的互作調(diào)控過程直接影響果實(shí)的品質(zhì)，激素調(diào)控的失衡是形成草莓畸形的重要原因之一[2-3]。因此，了解生長素與脫落酸及兩者互作對草莓果實(shí)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，篩選重要的調(diào)控因子，對開展草莓分子生物學(xué)育種及優(yōu)良草莓品種培養(yǎng)具有重要意義。

生長素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)受3個(gè)主要基因家族Aux/IAAs、SAURs 和GH3s 的調(diào)控[4]。生長素濃度較低時(shí)，Aux/IAAs與ARF(Auxin response factor)結(jié)合，抑制生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；生長素濃度較高時(shí)，生長素受體(TIR1/AFBs)與生長素結(jié)合后導(dǎo)致Aux/IAAs泛素化進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，使ARF從ARF-Aux/IAA聚合物中游離下來，從而激活生長素響應(yīng)信號(hào)[5-7]。

近年來對Aux/IAAs 家族基因在植物發(fā)育過程中的功能研究越來越受到重視，其家族基因的功能不斷被發(fā)掘[8-11]。Aux/IAA家族基因典型的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是Domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。Domain Ⅰ有轉(zhuǎn)錄抑制功能，具有一個(gè)LxLxLx典型基序；Domain Ⅱ?qū)ux/IAA 蛋白的穩(wěn)定性起作用，核心序列為GWPPV；Domain Ⅲ和Ⅳ負(fù)責(zé)蛋白的二聚化，可與生長素響應(yīng)因子ARF家族基因形成二聚體[12]。在擬南芥中的研究表明，大多數(shù)Aux/IAAs 家族成員大多與根的生長發(fā)育有關(guān)，如AtIAA28[13]、AtIAA19[14]、AtIAA14[15]等。水稻OsIAA9、OsIAA11對水稻側(cè)根的發(fā)育有重要調(diào)控作用[16-17]；馬鈴薯StIAA2下調(diào)表達(dá)使植株高度增加、葉柄表現(xiàn)出偏向下性、并降低了頂端葉原基生長的彎曲程度等[18]。目前，Aux/IAA家族基因已經(jīng)在馬鈴薯[19]、大豆[20]、白菜[21]、木瓜[22]、油菜[23]等多種果蔬中被分離和鑒定。

關(guān)于Aux/IAA家族基因在果實(shí)發(fā)育過程中的功能研究主要以番茄為模式植物進(jìn)行，抑制表達(dá)番茄SlIAA3蛋白使番茄植株對生長素的敏感性下降，從而表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢、葉片形態(tài)及乙烯可誘導(dǎo)表型的改變等[24]，抑制表達(dá)SlIAA9基因使植株表現(xiàn)出多種表型變化，如形成單葉，坐果過程提前發(fā)生[25]; 抑制表達(dá)Sl-IAA27后導(dǎo)致番茄果實(shí)變小[26]；而抑制表達(dá)Sl-IAA17，通過影響細(xì)胞的膨大過程使番茄果實(shí)增大[27]。而關(guān)于Aux/IAA家族基因在草莓發(fā)育過程中的功能研究進(jìn)展緩慢。

鑒于此，本研究以森林草莓(Fragariavesca)為試驗(yàn)材料，克隆得到森林FvIAA17基因，通過DNAMAN、ProtParam、TargetP、MEGA 5等生物信息學(xué)工具對其序列特征進(jìn)行分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對其表達(dá)特性進(jìn)行了初步的探究，以期為深入研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試材與處理

選用森林草莓為試材，材料種苗來源于西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，移栽種植于西安文理學(xué)院溫室大棚中，培養(yǎng)條件為溫度。采集成株盛期的根、莖、葉、花組織，果實(shí)取3個(gè)時(shí)期，即綠果(花后12 d)、1/2紅果(花后20～21 d)、紅熟果(花后25～26 d)，將植物材料用液氮冷凍，保存于-70 ℃冰箱備用。

取長勢良好的草莓幼苗，待其第5～6片葉子展開后，取地上部分分別置于蒸餾水、生長素(IAA，50 mg/L)、脫落酸(ABA，100 μmol/L)、IAA+ABA(終質(zhì)量濃度分別為50 mg/L和100 μmol/L)溶液中，分別于處理后0，1，6，12 h取材。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。試材液氮冷凍后存于-70 ℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 RNA提取試劑盒購于TIANGEN(北京)，按照說明書進(jìn)行RNA提取，利用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行RNA完整性檢測；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司(大連)，根據(jù)試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.2FvIAA17基因的克隆 以草莓葉片cDNA為模板，用Primer 6.0設(shè)計(jì)IAA17基因特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 35個(gè)循環(huán); 最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆子送往上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.3FvIAA17基因生物信息學(xué)分析 方法同文獻(xiàn)[28]。

1.2.4FvIAA17基因表達(dá)分析 利用Primer 6.0設(shè)計(jì)FvIAA17基因qPCR特異性引物(表1)，內(nèi)參為草莓Fv18S，引物由上海生工合成。qPCR采用羅氏FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒。方法步驟參照說明書進(jìn)行。每個(gè)樣品3次重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，同文獻(xiàn)[28]。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 FvIAA17的克隆和序列分析

以草莓葉片cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(圖1)。測序后得到約594 bp序列，分析后表明目標(biāo)基因序列一致。FvIAA17基因編碼197個(gè)氨基酸。預(yù)測其分子質(zhì)量為21.85 ku，等電點(diǎn)為7.56。

2.2 FvIAA17蛋白生物信息學(xué)分析

1.FvIAA17 基因克隆; M.M 2 000 bp Marker。1.Amplification of the FvIAA17 gene; M.M 2 000 bp Marker.

2.2.1FvIAA17基因啟動(dòng)子序列分析 分析表明(表2)，F(xiàn)vIAA17啟動(dòng)子區(qū)含有TATA框、CAAT框等調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件，同時(shí)還具有多種植物激素及逆境脅迫響應(yīng)元件，如ABA、MeJA茉莉酸甲酯誘導(dǎo)響應(yīng)、低溫、低氧脅迫元件等。

表2 FvIAA17啟動(dòng)子順式作用元件分析Tab.2 The cis-elements in the promoter of FvIAA17

2.2.2FvIAA17基因同源序列比對及進(jìn)化分析 利用DNAman軟件將FvIAA17與其他物種中同源性較高的氨基酸序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，F(xiàn)vIAA17的蛋白序列具有生長素誘導(dǎo)基因Aux/IAA家族典型的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。據(jù)編碼FvIAA17的氨基酸序列并結(jié)合其他植物同源氨基酸序列，利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖3)。結(jié)果顯示FvIAA17基因與蘋果MdIAA1基因的親緣關(guān)系最近。

NaIAA17-L.煙草(XP_019229757.1)； PaIAA1.甜櫻桃(XP_021817959.1)； AtIAA17.擬南芥(NP_171921.1); CcIAA17.黃辣椒(PHU24404.1)；RcIAA1.蓖麻(XP_002517529.1)； StIAA17-L. 馬鈴薯(XP_006343103.2)；VaIAA17.赤豆(XP_017425536.1)；CsIAA1.甜橙(XP_006465436.1)；PpIAA1.桃樹(XP_007215971.1)；FvIAA17.草莓(XP_004302956.1)；SiIAA14.芝麻(XP_011081682.1)；PbIAA1.白梨(XP_009339009.1)；GaIAA16.樹棉(XP_017605091.1)；QsIAA17.栓皮櫟(POF06625.1)；JrIAA17-L.胡桃(XP_018847560.1)； MdIAA1. 蘋果(XP_008377585.1)；MnIAA17. 桑樹(XP_010110305.1)。黑色下劃線為FvIAA174個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

NaIAA17-L.Nicotianaattenuate(XP_019229757.1); PaIAA1.Prunusavium(XP_021817959.1); AtIAA17.Arabidopsisthaliana(NP_171921.1); CcIAA17.Capsicumchinense(PHU24404.1); RcIAA1.Ricinuscommunis(XP_002517529.1); StIAA17-L.Solanumtuberosum(XP_006343103.2); VaIAA17.Vignaangularis(XP_017425536.1); CsIAA1.Citrussinensis(XP_006465436.1); PpIAA1.Prunuspersica(XP_007215971.1); FvIAA17.Fragariavesca(XP_004302956.1); SiIAA14.Sesamumindicum(XP_011081682.1); PbIAA1.Pyrus×bretschneideri(XP_009339009.1); GaIAA16.Gossypiumarboretum(XP_017605091.1); QsIAA17.Quercussuber(POF06625.1); JrIAA17-L.Juglansregia(XP_018847560.1); MdIAA1.Malusdomestica(XP_008377585.1); MnIAA17.Morusnotabilis(XP_010110305.1).The conserved domainⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ ofFvIAA17was marked by single black line.

圖2 草莓FvIAA17氨基酸序列和所選物種Aux/IAA家族基因氨基酸序列比對
Fig.2 Analysis of the FvIAA17 amino acid sequence and these selected Aux/IAA from other plant species

圖3 FvIAA17基因與其他植物Aux/IAAs基因進(jìn)化關(guān)系分析Fig.3 Phylogenetic relationship based on FvIAA17 amino acid sequence and other plant Aux/IAAs

2.2.3 FvIAA17亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)分析及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 利用Cello對FvIAA17蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(表3)，表中數(shù)值越大表明結(jié)果可信度越高。因此，F(xiàn)vIAA17蛋白定位于周質(zhì)間(表3)，具體定位情況仍需試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證確定。FvIAA17蛋白無信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)；磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)vIAA17有18個(gè)Ser、15個(gè)Thr和2個(gè)Tyr。

表3 FvIAA17亞細(xì)胞定位預(yù)測Tab.3 The information in predicting FvIAA17 subcellular localization

2.3 FvIAA17基因在草莓不同組織中的表達(dá)分析

以草莓Fv18S為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，草莓中FvIAA17在草莓根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，但相對表達(dá)量差異明顯，以目的基因在根中表達(dá)量為對照，其在綠果、莖和1/2紅果中表達(dá)量顯著增加，特別是在綠果和莖中表達(dá)量較高，分別比其在根中表達(dá)量高4.0，2.3倍(圖4)，可能與該基因在不同組織中的功能差異相關(guān)。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖5同。Different small letters show significantly different at 0.05.The same as Fig.5.

2.4 外源激素處理對FvIAA17基因表達(dá)水平的影響

RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)(圖5)，與無處理對照組相比，F(xiàn)vIAA17在IAA處理早期1，6 h受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，在處理后6 h達(dá)到最大表達(dá)量，而后隨著處理時(shí)間增長漸恢復(fù)正常水平；ABA處理草莓植株后，與對照組相比，F(xiàn)vIAA17的表達(dá)水平在處理1，6 h均呈顯著性下調(diào)趨勢，12 h后恢復(fù)正常水平；IAA+ABA處理后，F(xiàn)vIAA17基因表達(dá)模式與IAA處理趨勢相同，表現(xiàn)為先升高而后恢復(fù)，但上升的幅度有所下降，表明IAA和ABA聯(lián)合作用時(shí)，IAA的調(diào)控作用處于主導(dǎo)地位，IAA與ABA之間可能存在互作調(diào)控關(guān)系。

圖5 不同激素處理下FvIAA17相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of FvIAA17 gene under different hormone treatment.

3 結(jié)論與討論

草莓屬于薔薇科草莓屬，成熟過程中不形成乙烯合成高峰，屬于呼吸非躍變型果實(shí)。與呼吸躍變型果實(shí)相比，植物激素調(diào)控呼吸非躍變型果實(shí)成熟機(jī)理的研究發(fā)展緩慢。生長素是第一個(gè)被鑒定的植物激素，研究表明，生長素調(diào)控果實(shí)生長發(fā)育過程，特別是果實(shí)的膨大期，但對于果實(shí)的成熟有一定的抑制作用[29]。對草莓和葡萄成熟機(jī)制研究表明，生長素與ABA可能互作調(diào)控果實(shí)的成熟過程[30-31]，但二者互作的機(jī)制及關(guān)鍵的調(diào)控因子尚不清楚。生長素對草莓的花誘導(dǎo)控制及其授粉后果實(shí)的生長發(fā)育過程有重要調(diào)控作用，其分泌過多將導(dǎo)致草莓花芽分化異常、草莓畸形果等[32]。因此，生長素及其互作激素對草莓果實(shí)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究，特別是解析關(guān)鍵調(diào)控因子的功能對通過分子育種手段培育優(yōu)良草莓品種具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以森林草莓為材料，克隆得到FvIAA17基因全長，該基因CDS序列為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為21.85 ku和7.56。生物信息學(xué)分析可知，F(xiàn)vIAA17基因具有典型的Aux/IAA家族的4個(gè)保守區(qū)，進(jìn)化樹分析表明，F(xiàn)vIAA17與蘋果的MdIAA1基因親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR研究表明，F(xiàn)vIAA17基因在草莓的不同組織中均有表達(dá)，在綠果期果實(shí)中表達(dá)量最高，推測FvIAA17基因可能參與調(diào)控草莓果實(shí)早期的發(fā)育過程。外源激素IAA處理發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vIAA17基因在處理早期1,6 h受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，并在處理6 h后達(dá)到頂峰，而后漸恢復(fù)正常水平；ABA處理草莓植株，處理后1，6 hFvIAA17呈顯著性下調(diào)表達(dá)，而后漸恢復(fù)正常水平；IAA與ABA聯(lián)合處理草莓時(shí)，F(xiàn)vIAA17基因表達(dá)模式與IAA單獨(dú)處理時(shí)表達(dá)趨勢有相似性，但強(qiáng)度明顯下降，表明2種激素同時(shí)存在，對草莓FvIAA17基因的調(diào)控作用IAA處于主導(dǎo)地位，表明在草莓發(fā)育過程中，生長素和ABA對FvIAA17基因有一定的聯(lián)合調(diào)控作用，推測FvIAA17基因可能在響應(yīng)生長素和脫落酸互作調(diào)控草莓發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。

Aux/IAA家族基因在生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的重要成員之一，本研究結(jié)果可初步推測FvIAA17基因可能在草莓發(fā)育有一定的功能作用，并且可能參與生長素與脫落酸互作調(diào)控草莓果實(shí)發(fā)育過程，但對于FvIAA17基因?qū)Σ葺纳飳W(xué)功能和作用機(jī)制需通過遺傳轉(zhuǎn)化手段進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，進(jìn)而在分子水平上揭示FvIAA17基因調(diào)控草莓果實(shí)發(fā)育的機(jī)制，為將來草莓優(yōu)良品種的培育提供理論基礎(chǔ)。