利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯Badh2基因改良粳稻香味

孫慧宇，宋 佳，王敬國，劉化龍，孫 健，莫天宇，徐善斌，鄭洪亮，鄒德堂

(東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻是全球最主要的糧食作物之一，全世界約一半的人口以大米作為主食，伴隨著人們生活水平的不斷提高，人們對水稻的需求不僅停留在量上，也在尋求質(zhì)的提高。香味是衡量水稻品質(zhì)的標準之一，而且香米也具有很高的營養(yǎng)價值，富含多種維生素、氨基酸[1]，因此香味性狀越來越受到市場的青睞和人們的關(guān)注，同時也成為育種家們研究的熱點之一[2]。黑龍江省作為我國重要的水稻生產(chǎn)基地，近年來在香味性狀育種上也取得了顯著的成績[3]，但香稻遺傳背景較為單一，香稻品種大都是由五優(yōu)稻4號和綏粳4號為基礎(chǔ)衍生而來，導致黑龍江省優(yōu)質(zhì)香稻數(shù)量有限且遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。通過傳統(tǒng)的育種方法解決這一問題，具有周期長、突變方向不確定等缺點，所以急需利用新的遺傳改良手段進行粳稻的香味改良。

水稻香味基因由第8號染色體上的隱性基因Badh2控制，該基因由15個外顯子組成[4]，Badh2編碼1個甜菜堿醛脫氫酶，具有醛脫氫酶活性，催化甜菜堿醛、4-氨基丁醛(AB-ald)和3-氨基丙醛的氧化。Buttery等[5]研究表明，水稻中的香味物質(zhì)主要是2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)，在非香型水稻品種中，Badh2蛋白催化4-氨基丁醛的氧化，而4-氨基丁醛是2-AP的合成前體，當4-氨基丁醛被Badh2氧化后，抑制了2-AP的合成，因此，稻米喪失了香味。當Badh2基因發(fā)生功能突變時，導致Badh2蛋白喪失功能，不能催化4-氨基丁醛的氧化，造成4-氨基丁醛的積累，從而促進了2-AP的合成，使稻米產(chǎn)生香味[6]。Badh2只有全轉(zhuǎn)錄本未發(fā)生突變時才具有甜菜堿脫氫酶活性，如果部分堿基發(fā)生缺失或其他突變會導致該基因的翻譯提前終止[7-9]。

基因組編輯技術(shù)可以定向修飾和改造基因，且周期短、效率高，能有效地彌補傳統(tǒng)育種的不足?；蚪M編輯技術(shù)目前包含鋅指核酸酶技術(shù)(ZFNs)[10]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(TALENs)[11]以及CRIPSR/Cas9技術(shù)[12]等，這些編輯技術(shù)在基因組特定位置引發(fā)雙鏈斷裂(DSB)，引起細胞中的自我修復機制即非同源末端連接(NHEJ)，進而造成修復的位置發(fā)生小片段的堿基缺失或插入，導致目標基因的移碼突變[13]。但前兩項技術(shù)操作繁瑣，成本較高，而CRIPSR/Cas9系統(tǒng)因具有效率高、成本低、操作簡單等優(yōu)勢，近年來應(yīng)用的較為廣泛[14]，不僅成功地應(yīng)用于小鼠[15]、斑馬魚[16]、人[17]等多個物種中，而且在擬南芥、水稻、小麥、玉米、楊樹等植物中也成功實現(xiàn)了定點編輯[18-21]。水稻作為單子葉模式植物，CRIPSR/Cas9系統(tǒng)不僅應(yīng)用于水稻的基因功能研究[22-24]，而且在性狀遺傳改良方面也被廣泛地研究[25-27]，表明CRIPSR/Cas9系統(tǒng)對水稻的基因編輯可以穩(wěn)定地遺傳至下一代，該技術(shù)對水稻育種具有重大的意義。

本研究以高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的非香型粳稻品種東農(nóng)425為試驗材料，利用CRIPSR/Cas9技術(shù)，針對Badh2的第2和第3外顯子進行定點編輯，以期獲得香味顯著提高、無轉(zhuǎn)基因成分且主要農(nóng)藝性狀無顯著變化的純合突變材料，為加快香型粳稻品種的培育提供理論和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以東北農(nóng)業(yè)大學選育的非香型粳稻品種東農(nóng)425為轉(zhuǎn)基因受體材料，該品種具有耐寒性強、產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良等特點。本研究所用U3-gRNA、U6a-gRNA載體和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體均由華南農(nóng)業(yè)大學劉耀光院士惠贈。

1.2 gRNA靶點接頭引物設(shè)計

通過NCBI獲得Badh2基因(Os08g0424500)的CDS序列。利用CRISPR-GE網(wǎng)站(http://skl.scau.edu.cn/)[28]，針對Badh2的第2外顯子和第3外顯子分別設(shè)計了2對gRNA靶點接頭引物，B1-U3-T1-F/R、B1-U6a-T2-F/R(表1)以及B2-U3-T1-F/R、B2-U6a-T1-F/R(表1)，并且分析靶點的特異性，排除潛在脫靶序列。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 CRISPR/Cas9表達載體的構(gòu)建

參考Ma等[29]的方法進行2個載體構(gòu)建。①制備靶點雙鏈接頭。將設(shè)計好的上下游靶位點接頭引物混合，95 ℃處理30 s后移至室溫退火。②酶切。利用BsaⅠ內(nèi)切酶切割2對pYLgRNA-U3和pYLgRNA-U6a載體，再利用T4連接酶將上一步制備好的靶點接頭連入gRNA表達盒中。③兩輪巢式PCR。第1輪PCR：利用通用引物對連接好靶點的gRNA表達盒進行擴增。第2輪PCR：取上一輪產(chǎn)物稀釋20倍作為擴增模板，分別利用引物B1′/B2(表1)和B2′/BL(表1)對其進行擴增。④產(chǎn)物純化。電泳檢測2對靶點的gRNA表達盒PCR產(chǎn)物，符合條帶大小后切膠回收。⑤gRNA表達盒克隆到Cas9載體。此步驟基于“金門”克隆法，一邊酶切混合好的2對gRNA表達盒和2個pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體，一邊將2對靶點的gRNA表達盒連接到2個pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體上。⑥轉(zhuǎn)化及檢測。將2個連接好的載體通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Match1-T1中，菌落PCR檢測，提取陽性菌落質(zhì)粒。利用檢測引物NOSF/M13F-47(表1)對載體質(zhì)粒進行PCR，產(chǎn)物送華大公司測序，得到檢測無誤的質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。

1.4 T0轉(zhuǎn)基因植株的獲得和檢測

利用農(nóng)桿菌介導法分別將2個pYLCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA載體分別轉(zhuǎn)入東農(nóng)425水稻愈傷組織，經(jīng)過潮霉素篩選，分化出T0再生植株，經(jīng)過煉苗，移栽至溫室種植。在分蘗盛期，采用CTAB法提取T0植株葉片DNA，利用Cas9檢測引物Cas9-F/R(表1)進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物大小為572 bp，電泳結(jié)果為572 bp的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.5 Badh2基因靶點序列的測序分析

由于第一個載體的2個靶點相距較遠(1 062 bp)，因此，在2個靶點附近各設(shè)計了1對PCR引物，Seq(1)-T1-F/R和Seq(1)-T2-F/R(表1)，PCR產(chǎn)物理論大小為314，1 027 bp，而第2個載體的2個靶點相距較近(48 bp)，因此，針對第1個靶點的上游和第2個靶點的下游位置僅設(shè)計了1對PCR引物，Seq(2)-T-F/R(表1)，PCR產(chǎn)物理論大小為823 bp，將PCR產(chǎn)物送華大公司進行測序，測序結(jié)果利用劉耀光課題組的DSDecode解碼方法(http://dsdecode.scgene.com/)進行分析[30-31]，挑選純合植株留種繼續(xù)種植。

1.6 無T-DNA元件Badh2突變體的篩選及其香味檢測

T1純合的突變體植株和東農(nóng)425野生型植株在相同的條件下種植，采用CTAB法提取T1植株葉片DNA，利用Cas9檢測引物(表1)進行PCR檢測，不能擴增出目的條帶的植株是無T-DNA元件的純合突變植株。在成熟期，選取所有無T-DNA元件純合株系的單株和野生型植株進行香味檢測，本研究采用2種方法對突變體材料進行香味檢測：①咀嚼法。5人小組進行鑒定，取少量成熟的籽粒先進行咀嚼隨后吸氣，判斷籽料香味的濃郁程度[32]；②氫氧化鉀浸泡法。對成熟的籽粒進行去殼處理，研碎后稱取2 g放入帶蓋的培養(yǎng)皿中，加入10 mL 1.7%的KOH溶液，蓋上培養(yǎng)皿蓋保持密封，室溫浸泡15 min，打開培養(yǎng)皿蓋5人小組鑒定其香味濃郁程度。5人鑒定小組按香味的濃郁程度進行評級，等級分為0～3(0：無香味，1：淡香，2：香，3：濃香)，2種方法所得的香味等級取平均數(shù)。

1.7 T1植株農(nóng)藝性狀考察

在T1于成熟期對篩選出的香味突變植株和野生型植株的主要農(nóng)藝性狀進行考察，包括株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 東農(nóng)425野生型植株的Badh2基因檢測及靶點設(shè)計

Badh2基因由15個外顯子組成(圖1)，對受體材料東農(nóng)425的Badh2基因進行測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其CDS序列與日本晴相同，未發(fā)生突變。

本研究設(shè)計的第1個載體的2個靶點分別在第2和第3外顯子上，第2個載體的2個靶點均在第2外顯子上(圖2)。第1個載體的2個靶點相距1 062 bp，第2個載體的2個靶點相距48 bp。

圖1 Badh2基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Badh2 structure

下劃線序列為靶點序列，加粗序列為PAM序列。The underlined sequence is the target sequence and the bold sequence is the PAM sequence.

2.2 Badh2基因表達載體的構(gòu)建

利用PCR和“金門”克隆法將帶有靶點的gRNA連接到Cas9載體骨架上，構(gòu)建好的載體即為pYLCRISPR/Cas9-B1-gRNA和pYLCRISPR/Cas9-B2-gRNA載體(圖3)，以下簡稱B1和B2載體。利用AscⅠ酶切鑒定載體質(zhì)粒(圖4)，載體質(zhì)粒被切出1.1 kb，2個載體的酶切結(jié)果均符合預期條帶大小，表明2個靶點的gRNA表達盒順利連接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體上。為了進一步確定各靶點序列的準確性，利用gRNA表達盒通用引物NOSF/M13F-47(表1)對2個載體上的靶點進行PCR測序分析。結(jié)果表明，測序的各靶點序列與設(shè)計的靶點序列一致(圖5)，所構(gòu)建的2個載體可以進行下一步的水稻遺傳轉(zhuǎn)化試驗。

圖3 兩個pLYCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA載體的組裝圖Fig.3 The structure of two pLYCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA vectors

M.DM2000 DNA標記；B1、B2.構(gòu)建好的pLYCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA載體。M.DM2000 DNA Marker; B1，B2. pLYCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA vectors.

2.3 T0轉(zhuǎn)基因植株檢測

分別用帶有B1載體和B2載體的農(nóng)桿菌侵染東農(nóng)425，各獲得18株和19株再生植株，移栽后，在分蘗盛期利用CTAB法提取這37株葉片DNA，用Cas9檢測引物Cas9-F和Cas9-R鑒定Cas9載體元件是否整合到再生植株的基因組上，最終共篩選出32株轉(zhuǎn)基因陽性植株，B1載體的陽性植株有15株，命名為B1-#，B2載體的陽性植株有17株，命名為B2-#。利用設(shè)計好的特異性引物Seq(1)-T1-F/R、Seq(1)-T2-F/R和Seq(2)-T-F/R對陽性植株進行測序分析，結(jié)果表明，B1載體純合植株有5個，純合率為33.33%，B2載體的純合植株有9個，純合率為52.94%。可以看出，B2載體的T0陽性植株純合率更高。通過劉耀光課題組的DSDecode解碼方法(http://dsdecode.scgene.com/)，分析純合突變體的具體堿基突變類型(圖6)，在T0共獲得8種突變類型的植株，其中B1-2和B1-8、B1-9和B1-10的基因型完全一致，B2-12和B2-17、B2-6和B2-9以及B2-10和B2-11的基因型完全一致。B1載體的植株多為1 bp堿基的插入/缺失，而B2載體的植株出現(xiàn)了67，76 bp的大片段堿基缺失，詳細情況見圖6。

圖5 兩個pLYCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA載體的測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results for the two pYLCRISPR/Cas9-Badh2-gRNA plasmids

下劃線的堿基是靶點序列，省略的序列用連續(xù)小黑點表示，缺失的堿基用黑色連字符表示，插入的堿基用小寫字母表示。WT.野生型。The base with underline is the target sequence, the omitted sequences are shown by consecutive small black dots, the deleted bases are represented by black hyphens, the inserted bases are represented by lowercase letters. WT.Wild-type.

2.4 無T-DNA元件的Badh2突變體的檢測及香味鑒定

B1載體T0的純合突變體有3個基因型不同的株系，即B1-2/8、B1-9/10和B1-12，將其重新命名為B1-M1、B1-M2和B1-M3。B2載體T0的純合突變體有5個基因型不同的株系，即B2-1、B2-2/12/17、B2-3、B2-6/9和B2-10/11，將其重新命名為B2-M1、B2-M2、B2-M3、B2-M4和B2-M5。2個載體的8個T0純合株系和野生型株系種植在相同條件下，獲得T1株系，在分蘗盛期每個株系各選取30個T1單株提取葉片DNA，用Cas9-F/R引物進行PCR檢測，圖7為部分電泳結(jié)果圖，沒有擴增出目的條帶的植株為不含有轉(zhuǎn)基因元件的突變植株。B1載體的3個株系共篩選出26株無T-DNA元件的純合植株，B2載體的5個株系共篩選出39株無T-DNA元件的純合植株，載體的分離基本符合孟德爾遺傳規(guī)律。

M.DM2000 DNA標記;WT.野生型；1-22.T1轉(zhuǎn)基因植株。M.DM2000 DNA Marker; WT.Wild-type; 1-22.T1 transgenic plants.

在成熟期，采用咀嚼法和氫氧化鉀浸泡法對8個無T-DNA元件的純合株系進行香味檢測，同時對香味進行評級分析，2種方法所得等級取平均數(shù)(表2)。結(jié)果表明，所有純合突變株系均有不同程度的香味，有5個株系的香味等級大于2.5，表現(xiàn)為濃香；有2個株系表現(xiàn)為香；有1個株系的香味等級小于1.5，為淡香。其中B1載體的3個株系均為濃香，B2載體的B2-M1和B2-M4株系為濃香，B2-M2和B2-M3株系為香，B2-M5株系為淡香?？傮w上，B1載體株系的香味比B2載體株系的香味更為濃郁。

2.5 香味突變材料的主要農(nóng)藝性狀考察

在T1進一步對8個香味突變株系和野生型材料的株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒質(zhì)量進行了考察(圖8)。結(jié)果表明，Badh2基因成功編輯的后代除了株高與東農(nóng)425有顯著差異外，其余性狀均無明顯差異。本研究創(chuàng)建的Badh2純合突變體的主要農(nóng)藝性狀并未因Badh2基因的編輯而受到影響。

表2 東農(nóng)425野生型和純合突變植株的香味分析Tab.2 Fragrance analysis of Dongnong 425 wild-type and homozygous mutant plants

注:+.插入堿基；-.缺失堿基；N.未發(fā)生突變。

Note:+. A inserted base;-. A deleted base;N. No mutation.

WT.野生型；T1.T1無T-DNA元件植株；數(shù)值用平均數(shù)±標準差表示,不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(t檢驗)。WT.Wild-type; T1.Plants without T-DNA component in T1 generation; Values are shown as mean±SD.Different lowercase letters present significant difference at P<0.05 level by t-test.

3 結(jié)論與討論

香稻不僅有獨特的味道和良好的口感，而且具有很高的商業(yè)價值，市場占有率很高，一般價格是非香型大米的2～3倍，所以近年來成為育種家們的研究熱點。傳統(tǒng)的香稻育種大多是通過雜交和回交選育香稻品種，但因其后代分離不穩(wěn)定、試驗周期漫長、抗逆性較弱、產(chǎn)量較低等因素，所以培育出穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良香稻品種較為困難，難以打破原有遺傳背景的束縛[33]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，更加快捷、高效、穩(wěn)定，有效地彌補了傳統(tǒng)育種技術(shù)的不足。

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在脫靶效應(yīng)，但靶點越多脫靶可能性才越大[34]，另外，Tang等[35]的研究表明，通過設(shè)計高特異性的靶序列就可以有效避免脫靶效應(yīng)，本研究所構(gòu)建的2個載體，分別具有2個靶點，且選擇的均是高特異性的靶點，因此脫靶效應(yīng)可以忽略不計。

在T0成功獲得了各種類型的Badh2突變體，突變類型以純合突變和雙等位突變?yōu)橹鳎?個載體的T0植株純合率分別為33.33%，52.94%，B2載體2個靶點相距僅為48 bp，所以突變體的基因型出現(xiàn)了大片段缺失的情況，筆者推測正是由于堿基大片段缺失的出現(xiàn)，導致了植株純合概率的增加。雜合突變和雙等位突變的后代會發(fā)生功能減弱和無義突變的分離，影響了后代遺傳的穩(wěn)定性，而純合突變體的后代不會分離，所以在T0只選擇了純合突變體繼續(xù)播種。在T1對純合突變體的T-DNA元件進行PCR檢測，結(jié)果表明，T-DNA元件的后代分離符合孟德爾定律，因此，通過T0純合突變植株的自交，就可以在T1獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的純合植株。這些純合植株并未攜帶T-DNA元件，可直接應(yīng)用于水稻育種研究，培育新的香型水稻材料，加速了香型粳稻品種的選育進程。

香味的測定有多種方式，評價起來比較主觀，只用一種方法可能不是很準確，所以本研究應(yīng)用了2種方便快捷的香味檢測方式，對野生型和無T-DNA元件的純合突變體進行香味分析，Badh2的功能喪失型突變體具有不同程度的香味，達到了對非香型粳稻東農(nóng)425改良的目的，其中B1載體的突變體香味普遍要比B2載體的突變體更濃郁。B1載體同時對Badh2的2個外顯子進行了編輯，所以筆者推測，對Badh2基因多個外顯子的同時編輯，可能會造成更顯著的香味表型。為了了解轉(zhuǎn)基因植株后代的其他表型是否會受到影響，本研究對無轉(zhuǎn)基因元件突變體的主要農(nóng)藝性狀進行了考察，Badh2基因成功編輯的后代除了株高與東農(nóng)425有顯著差異外，其余性狀均無明顯差異，在編輯香味基因的同時，并沒有影響除株高以外的其他性狀。最終，本研究成功地利用CRISPR/Cas9技術(shù)對Badh2基因進行了定點編輯，并且獲得了不含有轉(zhuǎn)基因成分的香型水稻材料，為粳稻香味的研究提供了豐富的材料，且為加快香型粳稻的培育開辟了新途徑。