醋糟固態(tài)厭氧消化特性及微生物群落結(jié)構(gòu)分析

張周，張雅晶，周云龍，許之揚(yáng),3，施萬(wàn)勝，阮文權(quán)*

1(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(無(wú)錫市太湖湖泊治理股份有限公司，江蘇 無(wú)錫，214062) 3(江蘇晨潔再生資源科技有限公司，江蘇 張家港，215600)

醋糟是食醋生產(chǎn)過(guò)程中的主要廢棄物，主要成分為木質(zhì)纖維素、粗蛋白質(zhì)、糖類以及微量的脂類物質(zhì)，屬于食品加工行業(yè)廢棄物[1]。醋糟具有產(chǎn)量大、酸性大、含水率高等特點(diǎn)，我國(guó)醋糟年產(chǎn)量高達(dá)300萬(wàn)t，且仍以7%的速度增長(zhǎng)，若處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[2]?，F(xiàn)階段醋糟常規(guī)的處理方式有焚燒、填埋、堆肥、飼料化、培養(yǎng)基質(zhì)等，處理能力有限，經(jīng)濟(jì)效益不高，且容易造成二次污染等問(wèn)題[3]。厭氧消化是醋糟等有機(jī)廢棄物綜合處理的有效方式之一，能夠?qū)⑻穷?、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成沼氣，在規(guī)?；幚硗瑫r(shí)，實(shí)現(xiàn)資源化利用[4]。周冠男等[5]在中溫條件下將醋糟與豬糞、雞糞混合厭氧發(fā)酵，醋糟與豬糞、雞糞揮發(fā)性固體(volatile solid, VS)質(zhì)量比均為1∶3條件下，累積甲烷(CH4)產(chǎn)量分別為286.51、312.57 mL/g VS。但醋糟中木質(zhì)纖維素高度復(fù)雜和穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致厭氧消化水解速率受限。為了提高木質(zhì)纖維素的利用效率，通常采用酸堿浸泡、水熱處理等手段對(duì)醋糟進(jìn)行預(yù)處理。WANG等[6]采用10種不同方式對(duì)醋糟進(jìn)行預(yù)處理，顯示經(jīng)堿性H2O2預(yù)處理醋糟CH4產(chǎn)率提升51.7%。師楊蕾等[7]采用H2O2對(duì)醋糟進(jìn)行預(yù)處理，H2O2含量、溫度和預(yù)處理時(shí)間分別為4%、40 ℃和12 h條件下，累積CH4產(chǎn)量達(dá)302.0 mL/g，較未預(yù)處理組提升了54.4%。在實(shí)際處理過(guò)程中，預(yù)處理技術(shù)存在成本高，難以規(guī)模化應(yīng)用。因此，如何構(gòu)建高效的厭氧消化體系，強(qiáng)化醋糟中木質(zhì)纖維素水解，全面解析厭氧消化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律成為研究熱點(diǎn)。

本研究采用全混式反應(yīng)器構(gòu)建醋糟高固態(tài)連續(xù)式厭氧消化體系，逐步提高系統(tǒng)有機(jī)負(fù)荷(organic loading rate, OLR)[2.01～7.11 g/(L·d)]，馴化出高效的木質(zhì)纖維素降解菌群，強(qiáng)化系統(tǒng)厭氧消化功能。通過(guò)分析產(chǎn)CH4性能和中間代謝產(chǎn)物，掌握不同OLR條件下醋糟降解及轉(zhuǎn)化規(guī)律。同時(shí)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵體系的微生物群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律進(jìn)行解析，為掌握醋糟厭氧降解過(guò)程及其微生物群落多樣性奠定基礎(chǔ)，對(duì)醋糟厭氧消化工程化應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

厭氧發(fā)酵底物醋糟取自江蘇鎮(zhèn)江某食醋生產(chǎn)企業(yè)，主要包含稻殼類填充物和釀醋原料殘?jiān)?。接種物取自實(shí)驗(yàn)室餐廚垃圾厭氧反應(yīng)器，底物和接種物主要參數(shù)如表1所示。

表1 底物和接種物性質(zhì)Table 1 Characteristics of substrates and inoculum

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為自制臥式反應(yīng)器，容積為10 L，有效容積為8 L，通過(guò)電伴熱保持溫度在(37±1) ℃，攪拌電機(jī)、溫度探頭、電加熱系統(tǒng)、氣體流量計(jì)、回流泵等均通過(guò)控制系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。醋糟從反應(yīng)器頂部進(jìn)料口加入到反應(yīng)器中，經(jīng)發(fā)酵反應(yīng)后沼渣從反應(yīng)器底部出料口取出，沼渣經(jīng)板框壓濾固液分離后，沼液部分回流至臥式反應(yīng)器中(圖1)。發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣經(jīng)氣體收集裝置收集后進(jìn)行成分分析。

圖1 試驗(yàn)裝置圖Fig.1 Diagram of experimental equipment

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始前向反應(yīng)器裝入接種污泥至工作體積并進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以去除所有殘留底物。反應(yīng)器總運(yùn)行時(shí)間為170 d，通過(guò)逐步提高臥式反應(yīng)器負(fù)荷的方式將整個(gè)試驗(yàn)分為5個(gè)階段，分別為1～15 d、16～45 d、46～75 d、76～130 d、131～170 d，用編號(hào)I～V表述，對(duì)應(yīng)物料OLR(以VS計(jì))分別為2.01、3.98、5.16、6.06、7.11 g/(L·d)，物料停留時(shí)間分別為160、80、65、55、40 d。反應(yīng)器運(yùn)行期間，定時(shí)取樣檢測(cè)，通過(guò)指標(biāo)分析反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)，提供負(fù)荷提升依據(jù)，整個(gè)運(yùn)行過(guò)程系統(tǒng)含固率保持在15%左右。

1.4 指標(biāo)分析

總固體(total solid,TS)、VS和總氨氮(total ammonia nitrogen, TAN)采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析[8]；總碳、總氮通過(guò)元素分析儀(Vario MICRO cube，德國(guó)Elementar)進(jìn)行測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)采用氣相色譜(GC-2010 plus，島津)進(jìn)行測(cè)定；沼氣成分采用便攜紅外沼氣分析儀(GAS-BOARD 3200L，武漢四方)進(jìn)行測(cè)定；收集厭氧反應(yīng)器每個(gè)OLR結(jié)束時(shí)的樣品，貯存于-80 ℃ 以備后續(xù)DNA提取和微生物群落分析。根據(jù)操作說(shuō)明使用Powersoil?DNA提取試劑盒(MoBio，美國(guó))提取DNA。分別使用細(xì)菌通用引物對(duì)338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、古菌通用引物對(duì)524F10extF(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958RmodR(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)擴(kuò)增16S rRNA基因，構(gòu)建擴(kuò)增文庫(kù)。在MiSeq平臺(tái)(Illumina公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序，按照HU等[9]所述進(jìn)行原始序列分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧消化產(chǎn)氣性能分析

CH4產(chǎn)量是厭氧發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)，反映當(dāng)前發(fā)酵條件下物料的產(chǎn)CH4性能[10]。整個(gè)試驗(yàn)階段反應(yīng)器沼氣產(chǎn)量、CH4產(chǎn)量和CH4體積分?jǐn)?shù)如圖2所示。從整體上看，階段I～V沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)量均出現(xiàn)先下降后升高再降低的過(guò)程，在階段IV中CH4產(chǎn)量和沼氣產(chǎn)量均達(dá)到最大值。5個(gè)階段穩(wěn)定的沼氣產(chǎn)量分別為453、396、371、423、366 mL/g VS，對(duì)應(yīng)的CH4產(chǎn)量分別為251、205、199、226、182 mL/g VS，CH4的體積分?jǐn)?shù)基本維持在44.17%～59.39%。李倩等[11]研究不同OLR條件下醋糟厭氧消化，單位質(zhì)量底物沼氣和CH4產(chǎn)量均與本結(jié)果基本一致。分階段來(lái)看，在調(diào)整OLR初期，負(fù)荷提升對(duì)系統(tǒng)造成一定的沖擊，系統(tǒng)產(chǎn)甲烷性能受到影響，沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)量均出現(xiàn)突然降低的現(xiàn)象，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)CH4性能逐漸恢復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)。第Ⅱ～Ⅳ階段運(yùn)行至沼氣產(chǎn)量穩(wěn)定所需的時(shí)間分別為5、9、24 d，表明隨著OLR的提升，系統(tǒng)所需的適應(yīng)期逐漸增加。在階段Ⅱ中沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)量出現(xiàn)較大波動(dòng)，23～26 d CH4產(chǎn)量從420 mL/g VS迅速降低至287 mL/g VS，及時(shí)調(diào)整沼液回流比，使體系中產(chǎn)甲烷菌活性得以快速恢復(fù)[12]。第V階段OLR提升至7.11 g/(L·d)時(shí)，沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)量均低于階段IV，且隨著反應(yīng)器運(yùn)行并未上升，說(shuō)明該狀態(tài)下產(chǎn)甲烷性能受到抑制，OLR已超出發(fā)酵體系處理極限。戴小虎等[13]研究不同OLR對(duì)醋糟厭氧消化性能影響，當(dāng)OLR>3.56 g/(L·d)時(shí)，反應(yīng)體系出現(xiàn)明顯酸化，產(chǎn)CH4活性被嚴(yán)重抑制。CHEN等[14]研究OLR對(duì)醋渣厭氧消化過(guò)程穩(wěn)定性及微生物群落組成的影響，研究表明最適OLR為2.0 g/(L·d)，當(dāng)OLR升高至2.5 g/(L·d)會(huì)導(dǎo)致厭氧消化過(guò)程出現(xiàn)不可逆抑制。本研究利用全混臥式反應(yīng)器處理醋糟，在高OLR條件下，沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)率分別達(dá)423、226 mL/g，均優(yōu)于上述研究。

圖2 產(chǎn)甲烷性能變化情況Fig.2 Variations of methane characteristics during methane production performance experiment

2.2 系統(tǒng)穩(wěn)定性分析

VFAs和TAN是厭氧發(fā)酵過(guò)程重要的中間產(chǎn)物，VFAs也是產(chǎn)甲烷菌利用的重要底物，當(dāng)系統(tǒng)VFAs質(zhì)量濃度過(guò)量累積時(shí)，產(chǎn)甲烷菌活性受到抑制，對(duì)系統(tǒng)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。整個(gè)運(yùn)行過(guò)程系統(tǒng)TAN和VFAs質(zhì)量濃度如圖3所示。TAN質(zhì)量濃度在1.53～2.99 g/L波動(dòng)，整體呈現(xiàn)第Ⅰ和Ⅱ階段高于其他階段，在前30 d TAN質(zhì)量濃度維持在較高水平，在第25天達(dá)到最大值2.99 g/L。VFAs質(zhì)量濃度在階段I～I(xiàn)V均呈現(xiàn)出先上升后下降，最后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。增加系統(tǒng)OLR初期時(shí)，一方面體系內(nèi)有機(jī)物水解酸化，快速產(chǎn)生有機(jī)酸，另一方面，OLR提升導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌活性降低，VFAs產(chǎn)生累積[15]。VFAs質(zhì)量濃度在前27 d持續(xù)上升，最高達(dá)11.41 g/L。有研究表明，發(fā)酵體系內(nèi)VFAs質(zhì)量濃度超過(guò)10 g/L時(shí)，會(huì)導(dǎo)致pH降低，產(chǎn)甲烷菌活性受到抑制[16]。為避免系統(tǒng)進(jìn)一步惡化，及時(shí)調(diào)整沼液回流比從100%降至75%，以消除氨氮的持續(xù)積累，降低系統(tǒng)TAN和VFAs質(zhì)量濃度，解除抑制現(xiàn)象。系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后VFAs質(zhì)量濃度基本維持在9 g/L左右，未發(fā)生酸抑制現(xiàn)象。隨著OLR提升至7.11 g/(L·d)，VFAs質(zhì)量濃度在8.94～13.47 g/L產(chǎn)生明顯波動(dòng)，系統(tǒng)穩(wěn)定性被破壞，產(chǎn)甲烷菌不能穩(wěn)定利用VFAs，導(dǎo)致VFAs質(zhì)量濃度波動(dòng)，CH4產(chǎn)率降低等現(xiàn)象。

圖3 TAN和VFAs濃度變化Fig.3 Changes in TAN and VFAs concentrations

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 微生物群落多樣性

為了解醋糟厭氧消化微生物群落結(jié)構(gòu)，采用高通量測(cè)序技術(shù)解析不同OLR條件下的反應(yīng)體系。細(xì)菌和古菌豐富度多樣性指數(shù)如表2所示，所有樣品Coverage指數(shù)均>99%，表明測(cè)序深度基本可反映樣品中絕大多數(shù)細(xì)菌和古菌的真實(shí)情況。分析代表微生物豐富度的Chao1和Ace指數(shù)可知，階段I～I(xiàn)V細(xì)菌群落豐富度隨著OLR增加出現(xiàn)先下降后上升的過(guò)程，階段IV樣品中Chao1和Ace指數(shù)最高，說(shuō)明群落豐富度最高。相對(duì)細(xì)菌而言，古菌豐度較低，同時(shí)隨著反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)古菌豐度逐漸降低。分析表征微生物多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)可知，在前4個(gè)階段細(xì)菌群落多樣性同樣經(jīng)歷先下降后上升的過(guò)程，反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中操作參數(shù)的優(yōu)化使得與醋糟降解相關(guān)的微生物得到保留和增殖，而與醋糟降解無(wú)關(guān)的微生物則被淘汰。古菌多樣性與細(xì)菌呈現(xiàn)基本相同的趨勢(shì)。在厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高，產(chǎn)沼氣性能越好[17]。然而，過(guò)高的OLR引起了階段V微生物群落多樣性的顯著降低，底物水解效率降低，產(chǎn)沼氣性能變差，這與2.1研究結(jié)果一致。

表2 細(xì)菌和古菌多樣性分析結(jié)果Table 2 Diversity analysis of bacterial and archaeal communities

2.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

厭氧消化水解過(guò)程是通過(guò)多種微生物共同完成，而富含木質(zhì)纖維素的醋糟產(chǎn)CH4性能高度依賴于水解過(guò)程，因此，系統(tǒng)細(xì)菌群落的組成及相對(duì)豐度將在水解代謝過(guò)程中起到?jīng)Q定性作用。各運(yùn)行階段細(xì)菌在門和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)如圖4所示。圖4-a顯示在門分類水平上，系統(tǒng)中細(xì)菌主要是擬桿菌門Bacteroidetes,45.6%～95.5%)和厚壁菌門(Firmicutes,4.38%～53.1%)，F(xiàn)irmicutes是水解酸化階段的主要菌群，能夠?qū)Υ自愕扔袡C(jī)物進(jìn)行水解；Bacteroidetes是富氮底物厭氧發(fā)酵的關(guān)鍵菌，能夠加速分解醋糟中不易降解的有機(jī)物[18]。整個(gè)運(yùn)行階段這2種細(xì)菌相對(duì)豐度之和均達(dá)98%以上，但不同運(yùn)行階段Bacteroidetes和Firmicutes相對(duì)豐度占比有一定差異。階段Ⅱ中Firmicutes相對(duì)豐度僅為4.38%，可能是由于大量的沼液回流使體系中TAN和VFAs濃度升高，系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度迅速降低，導(dǎo)致水解過(guò)程受阻，厭氧消化受到抑制，系統(tǒng)CH4產(chǎn)量降低。隨著及時(shí)調(diào)整回流比，階段Ⅲ中Firmicutes相對(duì)豐度上升至27.8%，系統(tǒng)產(chǎn)CH4性能恢復(fù)。階段IV中Bacteroidetes和Firmicutes相對(duì)豐度最均衡，分別為45.6%和53.1%，此階段2種菌群協(xié)同作用，醋糟水解過(guò)程和產(chǎn)CH4性能最佳。

a-門水平細(xì)菌多樣性；b-屬水平細(xì)菌多樣性圖4 細(xì)菌在門和屬水平上群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Analysis of bacterial at the phylum and genus levels

2.3.3 古菌群落結(jié)構(gòu)變化

a-門水平古菌多樣性；b-屬水平古菌多樣性圖5 古菌在門和屬水平上群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Analysis of archaeal diversities at the phylum and genus levels

不同OLR條件下系統(tǒng)古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化，但是不管在門水平還是屬水平上，古菌群落差異度明顯要低于細(xì)菌群落差異度。按照氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)CH4途徑(Methanobacterium、Methanoculleus)和混合營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)CH4途徑(Methanosarcina、Methanomassiliicoccus、Bathyarchaeota_norank)對(duì)古菌屬進(jìn)行分類，具體分布情況如圖6所示。整個(gè)運(yùn)行過(guò)程氫營(yíng)養(yǎng)型古菌屬均占主導(dǎo)，相對(duì)豐度分別為66.0%、61.38%、71.11%、66.64%和93.50%，在前4個(gè)階段，氫營(yíng)養(yǎng)型古菌屬和混合營(yíng)養(yǎng)型古菌屬相對(duì)豐度保持穩(wěn)定，相對(duì)豐度比例基本維持在2∶1，多樣的產(chǎn)CH4途徑表明醋糟各類型水解產(chǎn)物均能夠被有效利用。隨著OLR提升，第V階段氫營(yíng)養(yǎng)型古菌屬相對(duì)豐度快速提升，混合營(yíng)養(yǎng)型古菌屬相對(duì)豐度降低至6.46%，此時(shí)氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)CH4途徑占絕對(duì)主導(dǎo)，混合營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)CH4途徑受阻，影響脂肪酸的轉(zhuǎn)化和代謝，這也是影響第V階段CH4產(chǎn)率下降的重要因素。

圖6 各階段不同代謝途徑古菌屬分布情況Fig.6 Distribution of archaea genus in different metabolic pathways

3 結(jié)論

(1)全混式固態(tài)厭氧消化體系能夠?qū)Υ自氵M(jìn)行高效處理，OLR為6.06 g/(L·d)條件下表現(xiàn)出最佳的消化性能，沼氣產(chǎn)量和CH4產(chǎn)率分別達(dá)423、226 mL/g VS，進(jìn)一步提升運(yùn)行負(fù)荷，超出處理極限，系統(tǒng)產(chǎn)氣性能降低。

(2)整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中TAN質(zhì)量濃度呈先上升后下降趨勢(shì)，穩(wěn)定運(yùn)行階段VFAs質(zhì)量濃度基本維持在9 g/L左右，系統(tǒng)未發(fā)生酸抑制現(xiàn)象。在25 d左右時(shí)，TAN和VFAs質(zhì)量濃度達(dá)到最大值分別為2.99、11.41 g/L，產(chǎn)甲烷活性受到抑制，及時(shí)調(diào)整沼液回流比，系統(tǒng)快速恢復(fù)。

(3)細(xì)菌門水平上主要以擬桿菌門(Bacteroidetes，45.6%～95.5%)和厚壁菌門(Firmicutes，4.38%～53.1%)為主，4種與木質(zhì)纖維素代謝有關(guān)的菌屬相對(duì)豐度從第I階段的23.09%提升至第IV階段的50.04%，有利于形成各種代謝途徑促進(jìn)底物高效水解，表現(xiàn)出最佳產(chǎn)氣性能。

(4)氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑在醋糟固態(tài)厭氧發(fā)酵體系內(nèi)占主導(dǎo)，前4個(gè)階段，氫營(yíng)養(yǎng)型古菌屬和混合營(yíng)養(yǎng)型古菌屬相對(duì)豐度比例基本維持在2∶1，各類型水解產(chǎn)物均能被體系中多樣的產(chǎn)CH4途徑利用。