正交實驗優(yōu)選荊丹子巴布劑提取工藝研究

韓潤，唐英，姚譞（通訊作者）

（1.上海張江中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海 201203；2.上海中藥制藥技術(shù)有限公司，上海 201203）

0 引言

荊丹子巴布劑由紫荊皮，黃荊子，牡丹皮等9味中藥組成，是在石氏傷科著名的外用藥三色敷的基礎(chǔ)上優(yōu)化而來的，源于國醫(yī)大師石仰山先生多年臨床試驗的經(jīng)驗方，已在臨床上應(yīng)用長達30年之久，用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)引起的關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛，活動受限等，療效確切，未見不良反應(yīng)[1-3]。傳統(tǒng)方法以水提工藝路線提取后制成外用巴布劑，考慮到處方中的揮發(fā)性及其他脂溶性成分在傳統(tǒng)工藝中不能充分提取，我們在此基礎(chǔ)上以芍藥苷和總黃酮的含量為指標對工藝進行優(yōu)化[4-7]。首先，我們考察了不同提取溶劑對處方中有效成分的影響；其次，以正交試驗考察了煎煮次數(shù)、煎煮時間和加溶劑量優(yōu)先最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫荊皮、黃荊子、梔子、牡丹皮、大黃、赤芍、獨活、五加皮、天南星（均購自上海上藥華宇藥業(yè)有限公司）。乙醇、甲醇（分析純，國藥）；甲醇（色譜純，Mer ck）Agil ent 1260高效液相色譜儀（美國）；電子天平(BT224S賽多利斯)；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；AS20500BDT 超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；實驗室純水系統(tǒng)(mil l ipor e)。

1.2 芍藥苷含量測定

（1）色譜條件。ODS-3 C18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 μm），甲醇：水（20:80）洗脫時間：20 min；流速：1 mL?min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長230 nm。

（2）標準品及供試品制備。①供試品制備：取凍干浸膏中粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇溶液25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。②標準品配制：取芍藥苷標準品12.15 mg，精密稱定，加甲醇制成濃度為每mL含0.486 mg的溶液。

（3）專屬性試驗。按照上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果表明，處方中其他雜質(zhì)不干擾測定。

圖1 HPLC專屬性實驗圖譜

（4）標準曲線建立。取濃度為0.486、0.243、0.122、0.061、0.031 mg?mL-1的芍藥苷對照品，分別進樣10 μL分析，以對照品含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程為Y=13689X+25.65，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，在0.031-0.486 mg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（5）穩(wěn)定性試驗。取供試品溶液在（1）所述的色譜條件下，于0, 2,4,8,12,24 h進樣并測定峰面積，RSD=0.37%，說明樣品穩(wěn)定性良好。

（6）精密度試驗。將芍藥苷標準品溶液分為高、中、低三個濃度，同日連續(xù)進樣6次的RSD分別為0.16，0.17，0.28%，表明日內(nèi)精密度良好；隔天進樣，連續(xù)3 天的RSD為0.58，0.64，0.72%，表明日間精密度良好。

（7）重復(fù)性試驗。按（2）方法制備供試品溶液6份，以0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣10 μL分析， RSD=0.94%。

（8）回收率試驗取。已知含量的供試品，精密加入芍藥苷對照品，按樣品測定方法制備供試液，測得平均回收率為102.4%，RSD=1.53%(n=6)，回收率均符合相關(guān)規(guī)定。

（9）樣品含量測定。稱取用水、50%醇、65%醇、80%醇提取的凍干浸膏以及正交試驗中凍干浸膏中粉約0.5 g，按供試品制備方法制備并進樣分析，測定浸膏中芍藥苷的含量。

1.3 總黃酮含量測定

（1）標準品及供試品配制：①供試品配制：取凍干浸膏中粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。②標準品配制：稱取蘆丁標準品15.36 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，稀釋至1.536、0.768、0.384、0.192、0.096 mg?mL-1備用。

（2）標準品及供試品處理方法。取供試品、蘆丁對照品1 mL加0.1 mol?L-1三氯化鋁顯色劑溶液2 mL，再加1 mol?L-1醋酸鈉溶液4 mL至于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。于65 ℃水浴顯色25 min，在510 nm波長處測定吸光度。[8-10]

（3）標準曲線建立。取濃度為1.536、0.768、0.384、0.192、0.096 mg?mL-1的蘆丁對照品按（2）項下方法顯色后在510 nm波長處測定吸光度，以對照品含量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程為Y=2.286X-0.004，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，在0.096-1.536 mg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（4）樣品含量測定。稱取用水、50%醇、65%醇、80%醇提取的干浸膏0.2 g，按供試品配制方法制備后按1.3.2項下方法處理后分析，測定干浸膏中總黃酮的含量。

1.4 提取工藝研究

傳統(tǒng)荊丹子傷膏為水提液，以傳統(tǒng)工藝為基礎(chǔ)對比考察水、50%醇、65%醇、80%醇不同提取路線對藥效及指標含量的影響。而后進一步進行正交工藝優(yōu)化。

（1）提取路線選擇。按處方平均投料4份，加溶劑煎煮2次，每次10倍溶劑、煎煮1 h，第一次煎煮前浸泡0.5 h，每次煎煮后300目濾布濾過，二次煎液合并，減壓濃縮密度1.1后得浸膏，提取溶劑分別為水、50%醇、65%醇、80%醇。以總黃酮（蘆丁計）和芍藥苷轉(zhuǎn)移率為指標，選擇最佳提取路線。

（2）提取工藝正交試驗。按正交試驗表L9(34)(n=3)，考察對煎煮工藝主要影響因素的水用量、煎煮時間、煎煮次數(shù)對煎煮效果的影響，正交試驗因素水平見表2，以總黃酮含量，芍藥苷轉(zhuǎn)移率，出膏為評價指標，含量及轉(zhuǎn)移率評分標準為di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；出膏評分標準為di=(Ymax-Ymin)/(Ymax-Ymin)。含量及轉(zhuǎn)移率以各占40%的權(quán)重設(shè)置總評分，出膏占20%的權(quán)重設(shè)置總評分。

2 結(jié)果

2.1 提取路線的選擇結(jié)果

提取路線的選擇結(jié)果見表1，隨著溶劑極性的減小，出膏降低，芍藥苷含量增加，轉(zhuǎn)移率在50%醇提路線中最高，總黃酮同在50%醇提方案中達到最高值。綜合考察以處方中總黃酮含量，芍藥苷轉(zhuǎn)移率為評價指標。最終以50%醇作為溶劑進一步研究。

表1 不同提取路線下的出膏率、芍藥苷、總黃酮

2.2 提取工藝正交試驗結(jié)果

提取工藝正交試驗結(jié)果見表2，表3，表4使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。正交結(jié)果顯示：以A3B2C3提取為最佳工藝。根據(jù)K值分析，以加溶劑量12倍對處方的提取效果最好；提取時間為1.5 h和2 h時提取效率均較好，且無顯著性差異，參考主效應(yīng)的方差分析表，認為效應(yīng)之間排序為提取次數(shù)＞提取倍數(shù)＞提取時間?？紤]到處方中有揮發(fā)油性藥材和煎煮成本，選擇B2為提取時間；提取次數(shù)為C2最佳。因此，最終我們采用A3B2C2路線為處方的提取工藝。

表2 正交試驗水平因素表

表3 L9（34）正交試驗及結(jié)果

2.3 工藝驗證實驗

按處方準確稱取185 g，共三份。按照選定的條件A3B2C2重復(fù)測定3次，結(jié)果見表5.三次實驗結(jié)果RSD均低于3%，證明該工藝穩(wěn)定性重復(fù)性良好，可行。

表4 DL（%）的主體間效應(yīng)的檢驗

表5 驗證實驗結(jié)果（%）

3 結(jié)論

中藥外治法，其歷史悠久、痛苦少、療效確切以及費用低而被臨床廣泛運用。膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“骨痹”、“膝痹”范疇。中醫(yī)中藥治療該病有獨特優(yōu)勢，中藥可改善局部微循環(huán)、降低骨內(nèi)壓、抗氧化和抑制自由基的產(chǎn)生、降低骨性關(guān)節(jié)炎細胞因子的產(chǎn)生等等[11]。本處方中君藥為紫荊皮和赤芍，芍藥苷在抗炎鎮(zhèn)痛方面具有良好的效果,同時還可以調(diào)控β-ar r est in2的表達，抑制FLS過渡增殖，調(diào)節(jié)c AMP趨于正常水平，從而抑制滑骨膜細胞的異常增殖，可能成為治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的機制之一[12-13]。同時芍藥苷也是2015年版《中國藥典》中赤芍項下規(guī)定含測指標。紫荊皮抗炎類成分主要為黃酮類，大量試驗證明黃酮類化合物具有顯著的抗炎效果，其抗炎機制主要是影響炎癥因子和前炎癥因子的產(chǎn)生和釋放以及細胞間的相互作用[14-15]。另外處方中黃荊子以及天南星均含有大量黃酮類活性成分[16-17]。故本研究以芍藥苷轉(zhuǎn)移率，總黃酮含量、出膏率為評價指標，以保證浸膏的制備質(zhì)量[18]。研究結(jié)果表明，以50%醇提的路線藥效結(jié)果最佳，同時總黃酮含量和芍藥苷轉(zhuǎn)移率最高。以最佳提取路線進行工藝研究，結(jié)合實際生產(chǎn)成本，確定了最佳提取工藝為12 倍量水，煎煮提取2 次，每次1.5 h。經(jīng)過三批小試工藝驗證，RSD均低于3%，證明該工藝穩(wěn)定可行。本課題開發(fā)的荊丹子巴布劑制備，提高了該制劑的質(zhì)量，減少刺激性，增加患者適應(yīng)性，為藥品生產(chǎn)與推廣提供了依據(jù)和保證，具有重要意義。