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    酵母相和菌絲相白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的比較

    2019-08-31 07:15:04王鈺婷王玉柱劉錦燕孟玲寧李衛(wèi)華項(xiàng)明潔
    中國真菌學(xué)雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:水平檢測(cè)

    王鈺婷 王玉柱 劉錦燕 孟玲寧 李衛(wèi)華 項(xiàng)明潔,

    (1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200025;2.復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,國家衛(wèi)生健康委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200032;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科,上海 200020)

    外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是由念珠菌引起的女性生殖道感染,其病原菌以白念珠菌為主,主要表現(xiàn)有外陰瘙癢、灼痛,嚴(yán)重時(shí)坐臥不安、尿急、尿頻等。流行病學(xué)資料顯示,約有70%~75%的女性一生中至少感染過1次VVC,作為女性生殖道感染最常見的原因之一,VVC在世界范圍內(nèi)十分常見,影響女性健康[4]。

    白念珠菌能夠在酵母相和菌絲相之間轉(zhuǎn)換,這種表型轉(zhuǎn)換的能力對(duì)其致病性和毒力有著重要影響。在VVC發(fā)生過程,陰道上皮細(xì)胞是白念珠菌侵襲的主要靶細(xì)胞,同時(shí),陰道上皮細(xì)胞可以通過釋放各種細(xì)胞因子從而調(diào)動(dòng)體液免疫和細(xì)胞免疫來防御白念珠菌感染。本研究通過熱滅活白念珠菌和活的白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,從而比較酵母相白念珠和菌絲相白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的差異。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    菌株與細(xì)胞株 菌株為白念珠菌SC5314(ATCC MYA-2876),由本實(shí)驗(yàn)室保存;細(xì)胞株為陰道上皮細(xì)胞株VK2/E6E7(ATCC CRL-2616)由美國哈佛大學(xué)Fichorova 博士惠贈(zèng)。

    試劑及耗材 K-SFM無血清培養(yǎng)基(含0.05g/L BPE牛垂體提取物、0.1g/L rEGF重組人上皮細(xì)胞因子、0.4 mmol/L CaCl2)購自Gibco公司。按配方(2%葡萄糖+2%蛋白胨+1%酵母提取物)配制液體酵母浸出粉胨葡萄糖 (yeast extract peptone dextrose,YPD ) 培養(yǎng)基、YPD 固體培養(yǎng)基。ELISA檢測(cè)試劑盒購自R&D Systems公司。RNA抽提試劑TrizolTMReagent購自Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real time)和qPCR檢測(cè)試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)購自Takara。引物由上海生工合成,序列見表1。IL-8的序列來自https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/,TNF-α和GAPDH的序列合成來自參考文獻(xiàn)。

    1.2 研究方法

    白念珠菌的制備 將復(fù)蘇的白念珠菌SC5314分區(qū)劃線于YPD培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落至3 mLYPD培養(yǎng)液中,并在30℃ 200 r/min的恒溫震蕩儀中孵育16 h。隨后用PBS調(diào)整菌液至109/mL,將菌置于100℃熱處理1 h可得到滅活的酵母相白念珠菌,在YPD培養(yǎng)基中37℃孵育48 h未生長,即為滅活成功[11]。感染陰道上皮細(xì)胞之前,用K-SFM培養(yǎng)基重懸菌液。

    陰道上皮細(xì)胞株傳代培養(yǎng)[12]37℃孵育5 min復(fù)蘇凍存細(xì)胞株;將復(fù)蘇的細(xì)胞接種至含K-SFM的培養(yǎng)瓶中,置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待融合率達(dá)到80%~90%進(jìn)行細(xì)胞傳代,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞量可達(dá)2×105/孔。細(xì)胞貼壁后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫刺激。

    表1 引物序列

    白念珠菌對(duì)陰道上皮細(xì)胞行免疫刺激 實(shí)驗(yàn)前吸棄6孔板中的培養(yǎng)液,將待測(cè)陰道上皮細(xì)胞分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組,第1組:加入1 mL K-SFM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照;第2~4組:每孔加入800 μL K-SFM培養(yǎng)基,200L白念珠菌活菌菌液,使菌液終濃度分別為2×105/mL(MOI=10),1×106/mL(MOI=50),2×107/mL(MOI=100);第5~7組:每孔分別加入200 μL MOI=10、50、100的白念珠菌滅活菌液,其余操作同活菌菌液。MOI(multiplicity of infection):感染指數(shù),此處即白念珠菌與VK2/E6E7細(xì)胞之比

    ELISA和RT-qPCR檢測(cè)TNF-α和IL-8 白念珠菌刺激上皮細(xì)胞3 h、6 h、12 h后,收集培養(yǎng)液,1000 g×20 min,提取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作,試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)作雙復(fù)孔,檢測(cè)TNF-α和IL-8的分泌水平。同時(shí)采用Trizol法抽提上皮細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè),反應(yīng)條件為:95℃ 30 s(1X);95℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s(40X),采用賽默飛StepOnePlus PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào),使用2-ΔΔt法處理數(shù)據(jù)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用GraphPad Prism7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,采用t檢驗(yàn)(Student’sttest)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 觀察白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞

    對(duì)照組中的陰道上皮細(xì)胞在K-SFM培養(yǎng)基中貼壁良好,細(xì)胞形態(tài)完整,多呈卵圓形或梭形、多角形鋪路石狀,胞漿均勻,輪廓清晰光滑(見圖1)。熱滅活白念珠菌和活的白念珠菌在K-SFM培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出不同的形態(tài):熱滅活白念珠菌在K-SFM培養(yǎng)基為酵母相,呈球形或橢球形;而活的白念珠菌則呈菌絲相,鏡下可見細(xì)長的菌絲。此外,當(dāng)兩種不同形態(tài)的白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞時(shí),酵母相白念珠菌聚集于陰道上皮細(xì)胞四周,而菌絲相白念珠菌的菌絲連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),覆于陰道上皮細(xì)胞之上。

    當(dāng)陰道上皮細(xì)胞受到白念珠菌的感染后,細(xì)胞形態(tài)隨著感染時(shí)間發(fā)生明顯的變化。感染3 h后,細(xì)胞變圓,貼壁不佳,部分細(xì)胞胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。當(dāng)MOI較大時(shí),細(xì)胞出現(xiàn)了膜裂解、胞核腫脹破裂、細(xì)胞形態(tài)不完整的情況,部分細(xì)胞破裂死亡。

    2.2 酵母相和菌絲相白念珠菌誘發(fā)陰道上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)

    通過檢測(cè)陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7分泌的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)酵母相和菌絲相白念珠菌均能在一定條件下誘導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

    陰道上皮細(xì)胞受到白念珠菌刺激后,IL-8和TNF-α的mRNA顯著上升(見表2)。在酵母相感染組中,IL-8和TNF-α mRNA的最大上升幅度在刺激3 h后出現(xiàn),且隨著MOI值的增大,細(xì)胞因子mRNA的最大上升幅度變小。甚至在MOI=100時(shí),所檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的最大上升幅度延遲至6 h出現(xiàn),且與對(duì)照相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(其中IL-8組P=0.330,TNF-α組P=0.273)。其次,在菌絲相感染組中,IL-8和TNF-α mRNA的變化趨勢(shì)與酵母相白念珠菌感染后的變化一致, 即隨著MOI值的增大,最大上升幅度變小,且峰值延遲出現(xiàn)。

    此外,白念珠菌刺激陰道上皮細(xì)胞后,細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基上清中的IL-8和TNF-α蛋白水平上升(見表3)??瞻讓?duì)照中未檢測(cè)到IL-8和TNF-α的表達(dá),但感染組細(xì)胞上清中均能在一定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到IL-8和TNF-α。在酵母相感染組中,IL-8早于TNF-α被檢測(cè)到,且隨著MOI值的增大,IL-8的水平也隨之升高,最大上升幅度出現(xiàn)得更早。然而,菌絲相白念珠菌感染后的細(xì)胞分泌IL-8的水平與酵母相相反,即隨MOI值的增大,IL-8的水平隨之下降,且最大上升幅度出現(xiàn)得更晚。

    2.3 酵母相和菌絲相白念珠菌誘發(fā)陰道上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度不同

    盡管酵母相和菌絲相白念珠菌均可刺激陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,但是兩者所誘發(fā)的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平有較大的差異(見圖2)。

    如圖2所示,無論是何種濃度的感染比例,菌絲相感染組細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8 mRNA水平均高于酵母相感染組。同樣,除了在MOI=10,3 h的條件下,其余條件下,酵母相感染組產(chǎn)生的TNF-α mRNA水平均高于酵母相感染組。

    此外,如圖3所示,對(duì)于IL-8蛋白表達(dá)組,當(dāng)MOI=10時(shí),菌絲相感染組的IL-8蛋白質(zhì)水平高于酵母相感染組。然而隨著MOI的增大,情況出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)。其次,由于檢測(cè)出TNF-α蛋白的時(shí)間點(diǎn)較少,無法比較同一時(shí)間點(diǎn)上兩相白念珠菌刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α蛋白的水平,但是根據(jù)表3的結(jié)果顯示,菌絲相感染組可以更早地產(chǎn)生TNF-α(3 h或6 h),而酵母相感染組則相對(duì)較遲地產(chǎn)生TNF-α(12 h)。

    圖1白念珠菌對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞形態(tài)的影響。采用不同的MOI(10,50,100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細(xì)胞3h后,100X鏡下觀察。Control:空白對(duì)照組,A、C、E:酵母相白念珠感染VK2/E6E7細(xì)胞,B、D、F:菌絲相白念珠菌感染VK2/E6E7細(xì)胞

    Fig.1The effect ofCandidaalbicanson morphology of VK2/E6E7.Candidaalbicansof different MOI(10,50,100)infect VK2/E6E7 cell lines under magnifications 100X. Control:Blank Control Group,A、C、E:YeastCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells,B、D、F:HyphalCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells

    表2 酵母相和菌絲相白念珠菌刺激陰道上皮細(xì)胞 VK2/E6E7 細(xì)胞因子和趨化因子mRNA分泌情況

    注:“a”示P<0.05,數(shù)據(jù)為與K-SFM培養(yǎng)基對(duì)照組相比,對(duì)照組的表達(dá)量均一化為1。

    表3 酵母相和菌絲相白念珠菌刺激陰道上皮細(xì)胞 VK2/E6E7 細(xì)胞因子和趨化因子蛋白質(zhì)的分泌情況

    注:“a”示P<0.05,“-”示未檢測(cè)出。數(shù)據(jù)為與未感染組K-SFM培養(yǎng)基對(duì)照組相比,單位:pg/mL.

    圖2酵母相和菌絲相白念珠菌刺激后,陰道上皮細(xì)胞 VK2/E6E7分泌IL-8和TNF-α mRNA水平的比較。采用不同的MOI(10、50、100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細(xì)胞。A-C:MOI=10,50,100感染組IL-8 mRNA水平。D-F:MOI=10,50,100感染組TNF-α mRNA水平

    ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    Fig.2IL-8 and TNF-α mRNA secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10,50,100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C:IL-8 mRNA expression of infection group with MOI=10,50,100. D-F:TNF-α mRNA expression of infection group with MOI=10,50,100. ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    圖3酵母相和菌絲相白念珠菌刺激后,陰道上皮細(xì)胞 VK2/E6E7分泌IL-8蛋白水平的比較。采用不同的MOI(10,50,100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細(xì)胞。A-C:MOI=10,50,100感染組IL-8 蛋白水平。***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    Fig.3IL-8 protein secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10,50,100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C:IL-8 protein expression of infection group with MOI=10,50,100

    ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    3 討 論

    白念珠菌是常見的條件致病菌,其可通過調(diào)控形態(tài)以適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境變化,酵母-菌絲相轉(zhuǎn)換及菌絲生長都與白念珠菌的致病力密切相關(guān)。目前關(guān)于白念珠菌引起疾病的研究多集中于系統(tǒng)性白念珠菌病,在系統(tǒng)性感染中,菌絲的形成可刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng),同時(shí)對(duì)于系統(tǒng)性感染小鼠模型的致死率往往也更高。而在由白念珠菌引起的外陰陰道炎中,現(xiàn)有的研究多局限于感染菌株耐藥性和機(jī)制的研究,宿主上皮細(xì)胞對(duì)白念珠菌刺激的免疫應(yīng)答研究有限。

    本研究通過構(gòu)建陰道上皮細(xì)胞體外模型,采用菌絲相和酵母相白念珠菌進(jìn)行免疫刺激,對(duì)陰道上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答進(jìn)行了觀察。我們的研究顯示,菌絲相白念珠菌引起陰道上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答早于酵母相白念珠菌,強(qiáng)度也高于后者。除了在MOI=10,3 h的條件下,酵母相白念珠菌刺激細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α mRNA水平高于菌絲相,其余條件下炎癥因子IL-8和TNF-α mRNA均為菌絲相感染組高于酵母相感染組。MOI=10時(shí),菌絲相感染組的IL-8蛋白質(zhì)水平均高于酵母相感染組。同時(shí),菌絲相感染組檢測(cè)到TNF-α蛋白水平的時(shí)間點(diǎn)(3 h或6 h)早于酵母相感染組(12 h)。說明在MOI=10時(shí),菌絲相白念對(duì)陰道上皮細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)更強(qiáng)。但是,隨著MOI的增大,情況出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)。這種情況可能是由于菌絲相侵襲力高于酵母相導(dǎo)致的,使得白念珠菌對(duì)于細(xì)胞的毒性作用大于激發(fā)炎癥。比如,Gao等使用不同MOI的活白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞,結(jié)果顯示隨著MOI的增大,胞內(nèi)釋放乳酸脫氫酶(LDH)水平增加,提示細(xì)胞毒性顯著提高,且細(xì)胞分泌IL-8蛋白質(zhì)水平隨之降低。此外,在口腔黏膜感染中,易于形成菌絲的白念珠菌刺激細(xì)胞分泌的炎癥因子高于菌絲缺陷株。本研究前期也曾用MOI=0.1,MOI=1感染過陰道上皮細(xì)胞,但是在較短時(shí)間內(nèi)(3 h)未能檢測(cè)到IL-8和TNF-α蛋白的分泌。我們因此認(rèn)為,研究白念珠菌刺激陰道上皮細(xì)胞的免疫機(jī)制,MOI=10的白念珠菌是較適宜的條件。

    不同時(shí)相白念珠菌感染陰道上皮細(xì)胞后產(chǎn)生炎癥因子的差異可能是由于其免疫機(jī)制不同。白念珠菌與宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵是其被宿主細(xì)胞識(shí)別。既往的研究發(fā)現(xiàn)在人體正常陰道組織中可表達(dá)TLR2和TLR4模式識(shí)別受體,而TLR2和TLR4可識(shí)別白念珠菌細(xì)胞壁外層中的甘露糖蛋白。此外,經(jīng)熱滅活處理后的白念珠菌能使其細(xì)胞壁最內(nèi)層-葡聚糖暴露,從而被C型凝集素受體Dectin-1識(shí)別,激起細(xì)胞的免疫反應(yīng)。然而目前,菌絲相和酵母相白念珠菌在陰道上皮細(xì)胞識(shí)別方面的機(jī)制為見深入報(bào)道。

    白念珠菌被識(shí)別后如何激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路的研究已屢見報(bào)道。白念珠菌的感染可激活以A431細(xì)胞系形成的陰道上皮層模型內(nèi)的MAPK通路,隨著菌絲形成增多,MAPK通路中的MKP1和c-Fos的活化逐漸增強(qiáng),菌絲逐漸浸潤上皮層。此外,白念珠菌可激活陰道上皮細(xì)胞的NF-ΚB信號(hào)通路,且VVC患者的陰道灌洗液中亦可查見NF-ΚB下游分子(TNF-α、IL-8、IL-6等)顯著增加[22]。

    本研究證實(shí)了菌絲相和酵母相白念珠菌均能誘發(fā)陰道上皮細(xì)胞出現(xiàn)顯著免疫反應(yīng)。在白念珠菌MOI=10的感染條件下,菌絲相白念引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)于酵母相白念。此外,不同時(shí)相的白念引起細(xì)胞免疫強(qiáng)度的差異提示了兩相白念珠菌引起免疫應(yīng)答的機(jī)制可能不同。

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