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    酵母相和菌絲相白念珠菌感染陰道上皮細胞免疫反應(yīng)的比較

    2019-08-31 07:15:04王鈺婷王玉柱劉錦燕孟玲寧李衛(wèi)華項明潔
    中國真菌學(xué)雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:水平檢測

    王鈺婷 王玉柱 劉錦燕 孟玲寧 李衛(wèi)華 項明潔,

    (1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科,上海 200025;2.復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院上海市計劃生育科學(xué)研究所,國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育藥具重點實驗室,上海 200032;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科,上海 200020)

    外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是由念珠菌引起的女性生殖道感染,其病原菌以白念珠菌為主,主要表現(xiàn)有外陰瘙癢、灼痛,嚴重時坐臥不安、尿急、尿頻等。流行病學(xué)資料顯示,約有70%~75%的女性一生中至少感染過1次VVC,作為女性生殖道感染最常見的原因之一,VVC在世界范圍內(nèi)十分常見,影響女性健康[4]。

    白念珠菌能夠在酵母相和菌絲相之間轉(zhuǎn)換,這種表型轉(zhuǎn)換的能力對其致病性和毒力有著重要影響。在VVC發(fā)生過程,陰道上皮細胞是白念珠菌侵襲的主要靶細胞,同時,陰道上皮細胞可以通過釋放各種細胞因子從而調(diào)動體液免疫和細胞免疫來防御白念珠菌感染。本研究通過熱滅活白念珠菌和活的白念珠菌感染陰道上皮細胞,檢測細胞因子的表達水平,從而比較酵母相白念珠和菌絲相白念珠菌感染陰道上皮細胞免疫反應(yīng)的差異。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    菌株與細胞株 菌株為白念珠菌SC5314(ATCC MYA-2876),由本實驗室保存;細胞株為陰道上皮細胞株VK2/E6E7(ATCC CRL-2616)由美國哈佛大學(xué)Fichorova 博士惠贈。

    試劑及耗材 K-SFM無血清培養(yǎng)基(含0.05g/L BPE牛垂體提取物、0.1g/L rEGF重組人上皮細胞因子、0.4 mmol/L CaCl2)購自Gibco公司。按配方(2%葡萄糖+2%蛋白胨+1%酵母提取物)配制液體酵母浸出粉胨葡萄糖 (yeast extract peptone dextrose,YPD ) 培養(yǎng)基、YPD 固體培養(yǎng)基。ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems公司。RNA抽提試劑TrizolTMReagent購自Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real time)和qPCR檢測試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)購自Takara。引物由上海生工合成,序列見表1。IL-8的序列來自https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/,TNF-α和GAPDH的序列合成來自參考文獻。

    1.2 研究方法

    白念珠菌的制備 將復(fù)蘇的白念珠菌SC5314分區(qū)劃線于YPD培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落至3 mLYPD培養(yǎng)液中,并在30℃ 200 r/min的恒溫震蕩儀中孵育16 h。隨后用PBS調(diào)整菌液至109/mL,將菌置于100℃熱處理1 h可得到滅活的酵母相白念珠菌,在YPD培養(yǎng)基中37℃孵育48 h未生長,即為滅活成功[11]。感染陰道上皮細胞之前,用K-SFM培養(yǎng)基重懸菌液。

    陰道上皮細胞株傳代培養(yǎng)[12]37℃孵育5 min復(fù)蘇凍存細胞株;將復(fù)蘇的細胞接種至含K-SFM的培養(yǎng)瓶中,置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待融合率達到80%~90%進行細胞傳代,將細胞轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),細胞量可達2×105/孔。細胞貼壁后,對細胞進行免疫刺激。

    表1 引物序列

    白念珠菌對陰道上皮細胞行免疫刺激 實驗前吸棄6孔板中的培養(yǎng)液,將待測陰道上皮細胞分為7個實驗組,第1組:加入1 mL K-SFM培養(yǎng)基作為空白對照;第2~4組:每孔加入800 μL K-SFM培養(yǎng)基,200L白念珠菌活菌菌液,使菌液終濃度分別為2×105/mL(MOI=10),1×106/mL(MOI=50),2×107/mL(MOI=100);第5~7組:每孔分別加入200 μL MOI=10、50、100的白念珠菌滅活菌液,其余操作同活菌菌液。MOI(multiplicity of infection):感染指數(shù),此處即白念珠菌與VK2/E6E7細胞之比

    ELISA和RT-qPCR檢測TNF-α和IL-8 白念珠菌刺激上皮細胞3 h、6 h、12 h后,收集培養(yǎng)液,1000 g×20 min,提取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作,試驗中標準品和樣本檢測時作雙復(fù)孔,檢測TNF-α和IL-8的分泌水平。同時采用Trizol法抽提上皮細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行實時熒光檢測,反應(yīng)條件為:95℃ 30 s(1X);95℃ 5 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s(40X),采用賽默飛StepOnePlus PCR儀檢測熒光信號,使用2-ΔΔt法處理數(shù)據(jù)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用GraphPad Prism7軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,采用t檢驗(Student’sttest)進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 觀察白念珠菌感染陰道上皮細胞

    對照組中的陰道上皮細胞在K-SFM培養(yǎng)基中貼壁良好,細胞形態(tài)完整,多呈卵圓形或梭形、多角形鋪路石狀,胞漿均勻,輪廓清晰光滑(見圖1)。熱滅活白念珠菌和活的白念珠菌在K-SFM培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出不同的形態(tài):熱滅活白念珠菌在K-SFM培養(yǎng)基為酵母相,呈球形或橢球形;而活的白念珠菌則呈菌絲相,鏡下可見細長的菌絲。此外,當兩種不同形態(tài)的白念珠菌感染陰道上皮細胞時,酵母相白念珠菌聚集于陰道上皮細胞四周,而菌絲相白念珠菌的菌絲連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),覆于陰道上皮細胞之上。

    當陰道上皮細胞受到白念珠菌的感染后,細胞形態(tài)隨著感染時間發(fā)生明顯的變化。感染3 h后,細胞變圓,貼壁不佳,部分細胞胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。當MOI較大時,細胞出現(xiàn)了膜裂解、胞核腫脹破裂、細胞形態(tài)不完整的情況,部分細胞破裂死亡。

    2.2 酵母相和菌絲相白念珠菌誘發(fā)陰道上皮細胞的免疫反應(yīng)

    通過檢測陰道上皮細胞VK2/E6E7分泌的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)酵母相和菌絲相白念珠菌均能在一定條件下誘導(dǎo)陰道上皮細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

    陰道上皮細胞受到白念珠菌刺激后,IL-8和TNF-α的mRNA顯著上升(見表2)。在酵母相感染組中,IL-8和TNF-α mRNA的最大上升幅度在刺激3 h后出現(xiàn),且隨著MOI值的增大,細胞因子mRNA的最大上升幅度變小。甚至在MOI=100時,所檢測細胞因子mRNA的最大上升幅度延遲至6 h出現(xiàn),且與對照相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(其中IL-8組P=0.330,TNF-α組P=0.273)。其次,在菌絲相感染組中,IL-8和TNF-α mRNA的變化趨勢與酵母相白念珠菌感染后的變化一致, 即隨著MOI值的增大,最大上升幅度變小,且峰值延遲出現(xiàn)。

    此外,白念珠菌刺激陰道上皮細胞后,細胞分泌到培養(yǎng)基上清中的IL-8和TNF-α蛋白水平上升(見表3)。空白對照中未檢測到IL-8和TNF-α的表達,但感染組細胞上清中均能在一定時間點檢測到IL-8和TNF-α。在酵母相感染組中,IL-8早于TNF-α被檢測到,且隨著MOI值的增大,IL-8的水平也隨之升高,最大上升幅度出現(xiàn)得更早。然而,菌絲相白念珠菌感染后的細胞分泌IL-8的水平與酵母相相反,即隨MOI值的增大,IL-8的水平隨之下降,且最大上升幅度出現(xiàn)得更晚。

    2.3 酵母相和菌絲相白念珠菌誘發(fā)陰道上皮細胞免疫反應(yīng)的強度不同

    盡管酵母相和菌絲相白念珠菌均可刺激陰道上皮細胞產(chǎn)生炎癥因子,但是兩者所誘發(fā)的IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達水平有較大的差異(見圖2)。

    如圖2所示,無論是何種濃度的感染比例,菌絲相感染組細胞產(chǎn)生的IL-8 mRNA水平均高于酵母相感染組。同樣,除了在MOI=10,3 h的條件下,其余條件下,酵母相感染組產(chǎn)生的TNF-α mRNA水平均高于酵母相感染組。

    此外,如圖3所示,對于IL-8蛋白表達組,當MOI=10時,菌絲相感染組的IL-8蛋白質(zhì)水平高于酵母相感染組。然而隨著MOI的增大,情況出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)。其次,由于檢測出TNF-α蛋白的時間點較少,無法比較同一時間點上兩相白念珠菌刺激細胞產(chǎn)生TNF-α蛋白的水平,但是根據(jù)表3的結(jié)果顯示,菌絲相感染組可以更早地產(chǎn)生TNF-α(3 h或6 h),而酵母相感染組則相對較遲地產(chǎn)生TNF-α(12 h)。

    圖1白念珠菌對VK2/E6E7細胞形態(tài)的影響。采用不同的MOI(10,50,100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細胞3h后,100X鏡下觀察。Control:空白對照組,A、C、E:酵母相白念珠感染VK2/E6E7細胞,B、D、F:菌絲相白念珠菌感染VK2/E6E7細胞

    Fig.1The effect ofCandidaalbicanson morphology of VK2/E6E7.Candidaalbicansof different MOI(10,50,100)infect VK2/E6E7 cell lines under magnifications 100X. Control:Blank Control Group,A、C、E:YeastCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells,B、D、F:HyphalCandidaalbicansinfect VK2/E6E7 cells

    表2 酵母相和菌絲相白念珠菌刺激陰道上皮細胞 VK2/E6E7 細胞因子和趨化因子mRNA分泌情況

    注:“a”示P<0.05,數(shù)據(jù)為與K-SFM培養(yǎng)基對照組相比,對照組的表達量均一化為1。

    表3 酵母相和菌絲相白念珠菌刺激陰道上皮細胞 VK2/E6E7 細胞因子和趨化因子蛋白質(zhì)的分泌情況

    注:“a”示P<0.05,“-”示未檢測出。數(shù)據(jù)為與未感染組K-SFM培養(yǎng)基對照組相比,單位:pg/mL.

    圖2酵母相和菌絲相白念珠菌刺激后,陰道上皮細胞 VK2/E6E7分泌IL-8和TNF-α mRNA水平的比較。采用不同的MOI(10、50、100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細胞。A-C:MOI=10,50,100感染組IL-8 mRNA水平。D-F:MOI=10,50,100感染組TNF-α mRNA水平

    ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    Fig.2IL-8 and TNF-α mRNA secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10,50,100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C:IL-8 mRNA expression of infection group with MOI=10,50,100. D-F:TNF-α mRNA expression of infection group with MOI=10,50,100. ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    圖3酵母相和菌絲相白念珠菌刺激后,陰道上皮細胞 VK2/E6E7分泌IL-8蛋白水平的比較。采用不同的MOI(10,50,100)的白念珠菌感染VK2/E6E7細胞。A-C:MOI=10,50,100感染組IL-8 蛋白水平。***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    Fig.3IL-8 protein secretion in VK2/E6E7 cells inoculated with yeastCandidaalbicanscompared with hyphalCandidaalbicans.Candidaalbicanswith different MOI(10,50,100)infecting VK2/E6E7 cells. A-C:IL-8 protein expression of infection group with MOI=10,50,100

    ***:P<0.001,**:P<0.01, *:P<0.05

    3 討 論

    白念珠菌是常見的條件致病菌,其可通過調(diào)控形態(tài)以適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境變化,酵母-菌絲相轉(zhuǎn)換及菌絲生長都與白念珠菌的致病力密切相關(guān)。目前關(guān)于白念珠菌引起疾病的研究多集中于系統(tǒng)性白念珠菌病,在系統(tǒng)性感染中,菌絲的形成可刺激機體產(chǎn)生更強的免疫反應(yīng),同時對于系統(tǒng)性感染小鼠模型的致死率往往也更高。而在由白念珠菌引起的外陰陰道炎中,現(xiàn)有的研究多局限于感染菌株耐藥性和機制的研究,宿主上皮細胞對白念珠菌刺激的免疫應(yīng)答研究有限。

    本研究通過構(gòu)建陰道上皮細胞體外模型,采用菌絲相和酵母相白念珠菌進行免疫刺激,對陰道上皮細胞的免疫應(yīng)答進行了觀察。我們的研究顯示,菌絲相白念珠菌引起陰道上皮細胞的免疫應(yīng)答早于酵母相白念珠菌,強度也高于后者。除了在MOI=10,3 h的條件下,酵母相白念珠菌刺激細胞產(chǎn)生的TNF-α mRNA水平高于菌絲相,其余條件下炎癥因子IL-8和TNF-α mRNA均為菌絲相感染組高于酵母相感染組。MOI=10時,菌絲相感染組的IL-8蛋白質(zhì)水平均高于酵母相感染組。同時,菌絲相感染組檢測到TNF-α蛋白水平的時間點(3 h或6 h)早于酵母相感染組(12 h)。說明在MOI=10時,菌絲相白念對陰道上皮細胞細胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)更強。但是,隨著MOI的增大,情況出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)。這種情況可能是由于菌絲相侵襲力高于酵母相導(dǎo)致的,使得白念珠菌對于細胞的毒性作用大于激發(fā)炎癥。比如,Gao等使用不同MOI的活白念珠菌感染陰道上皮細胞,結(jié)果顯示隨著MOI的增大,胞內(nèi)釋放乳酸脫氫酶(LDH)水平增加,提示細胞毒性顯著提高,且細胞分泌IL-8蛋白質(zhì)水平隨之降低。此外,在口腔黏膜感染中,易于形成菌絲的白念珠菌刺激細胞分泌的炎癥因子高于菌絲缺陷株。本研究前期也曾用MOI=0.1,MOI=1感染過陰道上皮細胞,但是在較短時間內(nèi)(3 h)未能檢測到IL-8和TNF-α蛋白的分泌。我們因此認為,研究白念珠菌刺激陰道上皮細胞的免疫機制,MOI=10的白念珠菌是較適宜的條件。

    不同時相白念珠菌感染陰道上皮細胞后產(chǎn)生炎癥因子的差異可能是由于其免疫機制不同。白念珠菌與宿主細胞相互作用的關(guān)鍵是其被宿主細胞識別。既往的研究發(fā)現(xiàn)在人體正常陰道組織中可表達TLR2和TLR4模式識別受體,而TLR2和TLR4可識別白念珠菌細胞壁外層中的甘露糖蛋白。此外,經(jīng)熱滅活處理后的白念珠菌能使其細胞壁最內(nèi)層-葡聚糖暴露,從而被C型凝集素受體Dectin-1識別,激起細胞的免疫反應(yīng)。然而目前,菌絲相和酵母相白念珠菌在陰道上皮細胞識別方面的機制為見深入報道。

    白念珠菌被識別后如何激活細胞內(nèi)相關(guān)通路的研究已屢見報道。白念珠菌的感染可激活以A431細胞系形成的陰道上皮層模型內(nèi)的MAPK通路,隨著菌絲形成增多,MAPK通路中的MKP1和c-Fos的活化逐漸增強,菌絲逐漸浸潤上皮層。此外,白念珠菌可激活陰道上皮細胞的NF-ΚB信號通路,且VVC患者的陰道灌洗液中亦可查見NF-ΚB下游分子(TNF-α、IL-8、IL-6等)顯著增加[22]。

    本研究證實了菌絲相和酵母相白念珠菌均能誘發(fā)陰道上皮細胞出現(xiàn)顯著免疫反應(yīng)。在白念珠菌MOI=10的感染條件下,菌絲相白念引起的免疫反應(yīng)強于酵母相白念。此外,不同時相的白念引起細胞免疫強度的差異提示了兩相白念珠菌引起免疫應(yīng)答的機制可能不同。

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