乳酸發(fā)酵技術(shù)的最新研究進(jìn)展

左希敏，劉濤

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

乳酸主要用于制藥、化妝品以及食品等行業(yè)。某些乳酸衍生物(如：乳酸酯)具有吸濕性和乳化性能，可用作乳化劑和食品改良劑[1]。乳酸聚合而成的聚乳酸具有生物相容性，可生物降解，有綠色生產(chǎn)的潛力，廣泛用作包裝、纖維和泡沫的原料[2]。但目前聚乳酸的生產(chǎn)技術(shù)尚不成熟，成本高，產(chǎn)量低。

乳酸可通過(guò)發(fā)酵和化學(xué)合成2種途徑生產(chǎn)[3]。通過(guò)化學(xué)合成的乳酸多是d/l-乳酸的外消旋混合物。發(fā)酵生產(chǎn)路線更具優(yōu)勢(shì)，底物可采用成本低的可再生資源且生產(chǎn)條件溫和，選擇合適的微生物能獲得光學(xué)純的d-或l-乳酸[4]。迄今為止，乳酸的生產(chǎn)大多通過(guò)發(fā)酵獲得。本綜述闡述了工業(yè)上乳酸生產(chǎn)的最近研究進(jìn)展。

1 最新生產(chǎn)技術(shù)

1.1 共培養(yǎng)

共培養(yǎng)是一種發(fā)酵技術(shù)，培養(yǎng)2種或多種具有特定相互作用的細(xì)胞群以產(chǎn)生確定的產(chǎn)物[5]。若1種細(xì)胞群不能單獨(dú)生長(zhǎng)，則需要其他細(xì)胞群體的存在，來(lái)刺激其生長(zhǎng)，所以要共培養(yǎng)。通過(guò)共培養(yǎng)進(jìn)行乳酸生產(chǎn)的文獻(xiàn)很有限，但最近的研究表明了這種技術(shù)的可行性。

有些乳酸菌由于其抑制發(fā)酵而產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物(如：乙酸和乙醇)，后續(xù)的分離和純化不僅降低了生產(chǎn)率，還增加了總體成本。因此，添加同型發(fā)酵微生物會(huì)導(dǎo)致這些乳酸菌選擇不同的代謝途徑將木糖轉(zhuǎn)化為乳酸，減少副產(chǎn)品的積累。有研究者采用短乳桿菌ATCC 367和植物乳桿菌ATCC 21028為共培養(yǎng)物，以兩種生物質(zhì)衍生的糖類為底物來(lái)生產(chǎn)乳酸。單獨(dú)使用短乳桿菌為異型發(fā)酵菌株，可同時(shí)消耗葡萄糖和木糖，但乳酸產(chǎn)量(0.52 g/g)非常低。當(dāng)短乳桿菌與植物乳桿菌共同培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)量(0.80 g/g)顯著增加，并且副產(chǎn)物積累較低[6]。

1.2 乳酸生產(chǎn)中的代謝工程

利用代謝工程對(duì)菌株進(jìn)行修飾后可以產(chǎn)生理想的效果，提高乳酸的產(chǎn)量，降低成本，減少副產(chǎn)物的形成[7]。菌株的耐酸性低，以及對(duì)底物的利用率低是乳酸生產(chǎn)中常見(jiàn)的問(wèn)題。雖然乳酸是乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，但是因?yàn)橥ㄟ^(guò)低效途徑代謝，導(dǎo)致乳酸的光學(xué)純度不純[8]。代謝工程可用于提高酸耐受性，重定向代謝途徑以更有效地消耗底物產(chǎn)生更純的乳酸。

傳統(tǒng)的代謝工程方法集中在通路重定向和異源基因表達(dá)上，現(xiàn)代代謝工程中鳥槍法突變技術(shù)更為常見(jiàn)[9]。宿主微生物中表達(dá)的每個(gè)基因都負(fù)責(zé)特定的代謝作用。因此，轉(zhuǎn)移基因的分析和宿主微生物的反應(yīng)對(duì)于該過(guò)程的成功至關(guān)重要。一些宿主微生物消耗完葡萄糖后,可能消耗最終產(chǎn)物來(lái)生長(zhǎng)，敲除d-乳酸脫氫酶編碼基因和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，d-乳酸的消耗被成功消除。此外，有些微生物會(huì)異型發(fā)酵代謝并產(chǎn)生乙醇等副產(chǎn)物[10]，可以通過(guò)敲除甘油-3-磷酸脫氫酶基因(GPD1和GPD2)來(lái)消除乙醇產(chǎn)生。乳酸降低了發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，負(fù)責(zé)弱酸性應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子的過(guò)度表達(dá)，增強(qiáng)了釀酒酵母對(duì)酸的適應(yīng)性。

1.3 乳酸生產(chǎn)的固定化生物反應(yīng)器

酶或細(xì)胞等生物催化劑的固定化能避免活性損失，實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，有效降低生產(chǎn)成本[11]。乳酸生產(chǎn)中，利用基因工程和代謝工程提高生物催化劑產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)率，固定化技術(shù)則能提高乳酸發(fā)酵的生產(chǎn)率。文章綜述了固定化生物反應(yīng)器的最新進(jìn)展。

1.3.1 連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器

連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器容量高，生產(chǎn)參數(shù)可控，反應(yīng)器系統(tǒng)完善，廣泛用于乳酸發(fā)酵。但發(fā)酵過(guò)程中的機(jī)械應(yīng)力劇烈，會(huì)引起支撐材料的爆裂或磨損[12]。使用該反應(yīng)器進(jìn)行絲狀真菌發(fā)酵時(shí)，易形成膠束狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致混合不良，由于傳質(zhì)限制，發(fā)酵的生產(chǎn)力往往很低，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)自固定化技術(shù)解決。使用連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器，利用自固定化技術(shù)形成米根霉顆粒來(lái)生產(chǎn)乳酸，大大提高生產(chǎn)力(3.75 g/L·h )[13]。為誘導(dǎo)自我固定，真菌要形成絮狀結(jié)構(gòu)，以便底物和氧氣有效地提供給真菌，因此應(yīng)仔細(xì)設(shè)計(jì)混合和充氣，否則將不利于乳酸生產(chǎn)。為了解決這些弊端，最近關(guān)于乳酸發(fā)酵的研究主要集中在雙生物反應(yīng)器系統(tǒng)上。該系統(tǒng)將連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器與填充床或纖維床等生物反應(yīng)器整合構(gòu)建，以獲得最大效率，這些反應(yīng)器系統(tǒng)可有效利用固定支持材料，并且細(xì)胞回收率高。

1.3.2 纖維床生物反應(yīng)器

細(xì)胞密度是乳酸生產(chǎn)的重要參數(shù)，纖維床生物反應(yīng)器能實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度成產(chǎn)，以獲得足夠的生產(chǎn)力。最初設(shè)計(jì)的纖維床生物反應(yīng)器是在螺旋卷管式生物反應(yīng)器中填充棉毛布，乳酸的生產(chǎn)率顯著提高。纖維床生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)要合理選擇生物反應(yīng)器中的固定化支持材料，以消除細(xì)胞和發(fā)酵液之間的擴(kuò)散限制。分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵均可適用于纖維床生物反應(yīng)器。有學(xué)者以菊芋作為底物，使用乳酸乳球菌ATCC 19435，在填充纏繞棉毛巾的玻璃柱制成的纖維床生物反應(yīng)器中進(jìn)行乳酸生產(chǎn)。與游離細(xì)胞系統(tǒng)相比，通過(guò)纖維床生物反應(yīng)器進(jìn)行分批發(fā)酵顯示出2倍的生產(chǎn)力(1.0 g/L · h)。進(jìn)行脈沖補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，因?yàn)橄说孜镆种?，生產(chǎn)率提高到1.57 g/L·h。更有趣的是，經(jīng)重復(fù)批次發(fā)酵可以提升生產(chǎn)率(2.85 g/L·h )，耐久性和長(zhǎng)期操作性(長(zhǎng)達(dá)800 h)。但在重復(fù)批次中，應(yīng)仔細(xì)確定底物的初始濃度，因?yàn)樗鼤?huì)影響最終的生產(chǎn)率[14]。還有學(xué)者利用纖維床生物反應(yīng)器采用菊粉芽孢桿菌Y2-8，以玉米粉為底物，通過(guò)分批、補(bǔ)料分批和重復(fù)批次發(fā)酵進(jìn)行乳酸生產(chǎn)，并觀察到類似結(jié)果[15]。在兩項(xiàng)研究中，重復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程中的固定化細(xì)胞必須通過(guò)適應(yīng)階段，以增加對(duì)高濃度水平底物的耐受性，在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，將底物濃度維持在低水平，未觀察到這種情況。因此，與分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵相比，補(bǔ)料分批發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)物消耗率更高。

1.3.3 填充床生物反應(yīng)器

填充床生物反應(yīng)器可將生物催化劑固定在生物反應(yīng)器中。生物催化劑固定不動(dòng)，發(fā)酵液從填充床生物反應(yīng)器的入口引入，以便沿著載體材料供給生物催化劑。填充床生物反應(yīng)器可適用于乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，該過(guò)程不需要氧氣。填充床生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)應(yīng)嚴(yán)密，填充柱的長(zhǎng)度不合理會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，并減少活細(xì)胞的數(shù)量[16]。

1.4 細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵

與傳統(tǒng)的連續(xù)乳酸發(fā)酵工藝相比，具有細(xì)胞再循環(huán)的先進(jìn)系統(tǒng)可在非常高的細(xì)胞密度下進(jìn)行乳酸生產(chǎn)，從而提高生產(chǎn)率。再循環(huán)系統(tǒng)與攪拌釜反應(yīng)器集成在一起，并插入微濾膜組件(主要是中空纖維)，顯著增強(qiáng)細(xì)胞的再循環(huán)，當(dāng)生物反應(yīng)器中生產(chǎn)完成時(shí)，將含有滲透物和細(xì)胞的生產(chǎn)培養(yǎng)基送至交叉流微濾模塊，并將細(xì)胞返回生物反應(yīng)器以繼續(xù)乳酸生產(chǎn)，同時(shí)將滲透物收集在單獨(dú)的儲(chǔ)庫(kù)中。

細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵系統(tǒng)應(yīng)該與泵系統(tǒng)連接，以連續(xù)傳輸滲透物和細(xì)胞。但由于頻繁的滅菌過(guò)程產(chǎn)生額外成本。在較大規(guī)模的乳酸生產(chǎn)過(guò)程中，連續(xù)生產(chǎn)可能會(huì)導(dǎo)致泵送系統(tǒng)結(jié)垢而減少流量，另外，乳酸菌在轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)受到剪切應(yīng)力，可能失去生物催化活性[17]。因此，優(yōu)化細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵系統(tǒng)的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，特別是在大規(guī)模的情況下。

1.5 同步糖化發(fā)酵

糖化是多糖水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖的過(guò)程，糖化過(guò)程可以促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程的底物轉(zhuǎn)化率。在常規(guī)發(fā)酵中，水解過(guò)程與發(fā)酵過(guò)程分開進(jìn)行。最近的許多研究集中在同步糖化發(fā)酵的應(yīng)用上。與傳統(tǒng)工藝相比，糖化過(guò)程與發(fā)酵過(guò)程在同一反應(yīng)器中進(jìn)行，發(fā)酵過(guò)程可直接利用水解產(chǎn)生的葡萄糖，解除產(chǎn)物反饋抑制[18]。有研究者用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)作為底物，研究了R.oryzae同步糖化發(fā)酵制備乳酸。與同一底物水平上進(jìn)行的其他研究相比，同步糖化發(fā)酵的乳酸生產(chǎn)率最高，為1 g/L·h[19]。劉冬梅等采用芽孢桿菌BCS 13002，以葡萄糖作為底物，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵，分批補(bǔ)料發(fā)酵得到L-乳酸含量為115.86 g/L,同步糖化發(fā)酵得到L-乳酸含量為123.3 g/L，且L-乳酸的光學(xué)純度均達(dá)到99.8%以上[20]。

2 結(jié)語(yǔ)

新技術(shù)的研究是提高乳酸生產(chǎn)率的關(guān)鍵。代謝工程作為菌株修飾的重要工具，以產(chǎn)生理想的菌株。此外，新的固定化技術(shù)和支持材料，可與生物反應(yīng)器系統(tǒng)有效地結(jié)合，來(lái)減少乳酸的生產(chǎn)成本，新的發(fā)酵技術(shù)(細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵)有效地提高了乳酸的生產(chǎn)率。