蛹蟲草子實體中類胡蘿卜素的組成與特性研究

洪 健 王化梅 向曉琴 雷 燦?

（生物資源保護與利用湖北省重點實驗室（湖北民族大學） 湖北恩施 445000）

蛹蟲草屬于子囊菌綱麥角菌科，是一種藥食兩用型真菌。近年來在國內(nèi)外受到了廣泛關(guān)注。蛹蟲草的藥用功能很多，如抗炎，[1]抗氧化，抗衰老，[2]抗癌等作用。蛹蟲草內(nèi)含有多種活性成分，如蟲草多糖，蟲草素，蟲草酸，類胡蘿卜素等，其中腺苷，蟲草素和蟲草類胡蘿卜素被認為是蛹蟲草的主要活性物質(zhì)。[4]目前，對于蛹蟲草已經(jīng)進行了大規(guī)模的人工培養(yǎng)，以期生產(chǎn)保健食品和獲得蟲草素、腺苷等生物活性成分。

類胡蘿卜素具有抗癌、抗氧化和增強視力等功能。蛹蟲草子實體內(nèi)含有豐富的類胡蘿卜素，可以作為類胡蘿卜素的食品補充劑。根據(jù)董靜洲[3]等人的研究證實蛹蟲草子實體經(jīng)過短波光刺激照射，其子實體中類胡蘿卜素的含量明顯增加，然而類胡蘿卜素的化學組成和化學特性尚不清楚。本文研究發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草子實體中類胡蘿卜素的組分、溶解性和定量方法，為蛹蟲草子實體的生產(chǎn)和利用提拱理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草由湖北省圣峰藥業(yè)有限公司提供；β-胡蘿卜素標準品；乙腈、乙酸均為色譜純，購自DIKMA公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機（深圳潔泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（ 杭州賽智科技有限公司）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ 賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；制備型高效液相色譜（杭州賽智科技有限公司）；紫外可見光分光光度計；濾膜。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件。HPLC色譜柱：C18硅膠色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.5 %乙酸溶液，梯度洗脫見表1；柱溫25 ℃；樣品進樣量 20 μL；流速1 mL/min。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 樣品預處理及樣品測定。蛹蟲草子實體的制備采用董靜洲的方法，[3]當蛹蟲草子實體表面覆滿金黃色孢子后，收獲子實體，并用硅膠干燥至恒重。將干燥后的蛹蟲草子實體打成粉末，過60目篩備用。

稱取0.5 g蛹蟲草子實體粉末溶于10 mL 80 %的乙醇溶液中，在3250 r/min條件下離心10 min，上清液過0.22 μm的濾膜（直徑5cm，上海市新亞凈化器件廠），將濾液置于紫外分光光度計上進行光譜掃描，得到相應(yīng)吸收峰；主吸收峰出現(xiàn)在425 nm，447 nm和475 nm（見圖1-A），這三個吸收峰皆為類胡蘿卜素的典型吸收光譜。濾液再經(jīng)HPLC進行分離。經(jīng)HPLC分離得到的單體組分由華中科技大學分析測試中心進行LC-MS分析。各單體組分的分子質(zhì)量和化學結(jié)構(gòu)由質(zhì)譜圖與紫外數(shù)據(jù)分析得出（見表2和圖1）。

1.3.3 類胡蘿卜素中各組分水溶性分析。稱取0.5 g研磨后的蛹蟲草子實體粉末，分別用10 mL濃度為0 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %和100 %的乙醇溶液進行浸提，浸提時間為12 h，提取物過濾膜（孔徑0.22μm，直徑：5cm，上海市新亞凈化器件廠），濾液通過高效液相色譜儀進行分析。以提取率來確定類胡蘿卜素中各組分的水溶性。

1.3.4 標準溶液的配置及各單體組分標準曲線的制作。以β-胡蘿卜素作為標準品，將其溶解于60 %的乙醇溶劑中，分別配置濃度為0.5，1，1.5，2，2.5， 3，3.5，4，5 μg/mL的標準液，檢測波長為447 nm。得到標準曲線為：Y= 0.157X + 0.0049，相關(guān)系數(shù)r2 = 0.9998，此處Y為吸光度，X為標準液的濃度。分析并計算回收率、精確度和準確度。

稱取200 g蛹蟲草子實體粉末，用60 %乙醇溶液進行提取，參照1.3.1中色譜的條件進行分離，用PHPLC分離出蛹蟲草中類胡蘿卜素，分別收集各單體組分，經(jīng)60 ℃真空干燥至恒重，然后利用利用HPLC做出此四種類胡蘿卜素的標準曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛹蟲草類胡蘿卜素的化學組分分析

經(jīng)HPLC分析，蛹蟲草子實體粉末中類胡蘿卜素出現(xiàn)4個主峰（見圖1-C），采用PHPLC分離得到這4種類胡蘿卜素的單體后，經(jīng)60 ℃真空干燥至恒重，溶于甲醇后在紫外分光光度計上進行光譜掃描，得到此4種類胡蘿卜素有相同吸收光譜（見圖1-B）,這表明此4種類胡蘿卜素有相同的共軛系統(tǒng)。

圖1 蛹蟲草類胡蘿卜素的紫外可見光譜和HPLC掃描

注：檢測波長447 nm；A：蛹蟲草子實體總提物的紫外可見光譜； B：4種蟲草黃素的紫外光譜； C：蛹蟲草類胡蘿卜素的HPLC分離結(jié)果；峰1：蟲草黃素-Ⅰ； 峰2：蟲草黃素-Ⅱ； 峰3：蟲草黃素-Ⅲ；峰4：蟲草黃素-Ⅳ

如表2所示，這四種類胡蘿卜素單體在質(zhì)譜數(shù)據(jù)上均存在共有碎片，表明它們具有相同的共軛系統(tǒng)，差異碎片則是共軛系統(tǒng)兩側(cè)不同的官能團。

表2 四種蟲草黃素的紫外-質(zhì)譜數(shù)據(jù)

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（見表2）和紫外光譜數(shù)據(jù)（見圖1-B），可以推出這4種類胡蘿卜素是黃素類物質(zhì)，結(jié)合IUPAC-IUB 規(guī)定的類胡蘿卜素命名方法，將這4種類胡蘿卜素單體命名為蟲草黃素，它們的具體結(jié)構(gòu)分別為：cordyxanthin-Ⅰ，cordyxanthin-Ⅱ，cordyxanthin-Ⅲ和cordyxanthin-Ⅳ。這四種蟲草黃素的化學結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

2.2 四種蟲草黃素的水溶性分析

四種蟲草黃素水溶性分析結(jié)果見圖3。隨著乙醇溶液的濃度的增大，4種蟲草黃素的提取率逐漸增加，當乙醇溶液達到60 %時，蟲草黃素的提取率達到最大，隨后提取率逐漸下降，乙醇濃度達到100 %時，其溶解度降至最低。然而β-胡蘿卜素是脂溶性的，其在無水乙醇中的溶解度最大，[6]這表明此4種蟲草黃素具有很強的水溶性。在實際應(yīng)用中，把干燥后的蛹蟲草子實體加入到沸水中進行沖泡，水的顏色漸漸變?yōu)樯铧S色，這一現(xiàn)象也說明了蛹蟲草子實體中含有的蟲草黃素溶入到了熱水中，表現(xiàn)出很強的水溶性，因而也易于被人體吸收。據(jù)此可以推測，在食品生產(chǎn)中蟲草黃素可以作為優(yōu)質(zhì)的色素來源和類胡蘿卜素的強化劑。

圖2 四種蟲草黃素的化學結(jié)構(gòu)

據(jù)文獻[6]報道，在柞蠶培養(yǎng)基上生長的蛹蟲草，其子實體中主要的類胡蘿卜素是葉黃素。本實驗中采用的是米飯培養(yǎng)基，在子實體中未檢測到葉黃素，這可能是因為培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的不同而導致子實體類胡蘿卜素組分的差異。通過與葉黃素的結(jié)構(gòu)進行對比發(fā)現(xiàn)，4種蟲草黃素甲基量減少，水溶性增強。將這4種蟲草黃素溶于石油醚中，經(jīng)紫外分光光度計掃描，未檢測到類胡蘿卜素的吸收光譜（圖4），進一步證明了這4種蟲草黃素具有很強的水溶性。

圖3 子實體在不同乙醇濃度中的提取率

據(jù)報道，類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素等普遍具有較強的抗癌活性。[2-4]與β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素相比較，蟲草黃素的水溶性很強，理論上蟲草黃素可能在抗癌方面也有很強的生物活性。因此值得進一步的研究。

2.2 蛹蟲草類胡蘿卜素各組分的定量分析

圖4 子實體石油醚提取物紫外可見光譜掃描

功能食品的質(zhì)量控制中，功能成分定量分析是至關(guān)重要的。本文中以β-胡蘿卜素作為標準品建立了蛹蟲草類胡蘿卜素的直接量化方法?；厥章蕿?9.79-102.13 %，精密度為0.19-1.01 %，準確性為99.13%-109.3 % （表3），這些數(shù)據(jù)表明即使子實體提取物中有其他化學成分，也可以采用直接鑒定的方法來檢測蟲草類胡蘿卜素的含量。我們測得蛹蟲草類胡蘿卜素的含量為1.27 mg/g干燥子實體，其中蟲草黃素III含量最多，有0.401 mg/g干燥子實體，蟲草黃素Ⅳ含量最少，只有0.175 mg/g干燥子實體，4種蟲草黃素占總蟲草類胡蘿卜素含量的86.7 %。

3 結(jié)論

蛹蟲草類胡蘿卜素經(jīng)分離和鑒定得到4種蟲草黃素類單體，分別命名為cordyxanthin-Ⅰ,cordyxanthin-Ⅱ, cordyxanthin-Ⅲ和 cordyxanthin-Ⅳ，其中蟲草黃素III含量最多。與常見的脂溶性類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素相比較，蟲草黃素具有很強的水溶性，更容易被人體吸收，在食品工業(yè)中可以作為優(yōu)質(zhì)色素來源和類胡蘿卜素強化劑進行開發(fā)利用。以β-胡蘿卜素作為標準品，可以在447 nm處檢測總蟲草黃素的含量。

表3 四種蟲草黃素的量化檢測