4株霍亂弧菌非產(chǎn)毒株溶源性噬菌體pre-CTXΦ的基因組結(jié)構(gòu)分析

李旭，趙林，樊粉霞，李哲，盧昕，逄波，闞飆

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 102206

分泌霍亂毒素(cholera toxin，CT)的霍亂弧菌產(chǎn)毒株可導(dǎo)致感染者發(fā)生劇烈的水樣腹瀉[1]，引起霍亂暴發(fā)和流行?；魜y弧菌包括一大類基因組明顯差異的菌群，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)200個(gè)血清群。引起霍亂暴發(fā)和流行的霍亂弧菌主要有O1和O139兩個(gè)血清群。霍亂毒素由ctxAB基因編碼，該基因位于霍亂弧菌溶源性絲狀噬菌體CTXΦ上[2]。CTXΦ的gⅢ基因編碼產(chǎn)物PⅢ能夠與霍亂弧菌的毒素共調(diào)菌毛(toxin co-regulated pilus, TCP)中的主要亞單位TcpA發(fā)生相互作用，因此，CTXΦ能以TCP為受體感染霍亂弧菌，并以霍亂弧菌染色體上的dif序列為特異整合位點(diǎn)，將CTXΦ基因組整合到霍亂弧菌染色體中，導(dǎo)致ctxAB發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，形成新的產(chǎn)毒霍亂弧菌[3]。

CTXΦ的基因組由重復(fù)序列2(repeat sequence 2，RS2)和核心區(qū)組成。RS2中含有與噬菌體復(fù)制和整合相關(guān)的rstA和rstB基因，另外還有抑制這2個(gè)基因表達(dá)的rstR基因。rstR編碼產(chǎn)生的RstR蛋白，能抑制CTXΦ超感染作用。核心區(qū)則由psh、cep、gⅢ、ace、zot和ctxAB基因組成，其結(jié)構(gòu)相對(duì)保守[2, 4]。此外，在CTXΦ的基因組結(jié)構(gòu)兩側(cè)，常見(jiàn)1個(gè)RS1結(jié)構(gòu)。RS1由rstR、rstA、rstB和rstC組成，作為CTXΦ的輔助噬菌體，發(fā)揮促進(jìn)CTXΦ的復(fù)制和整合作用[5]。rstA、rstB和rstC基因相對(duì)保守，而rstR基因的序列變異則非常明顯，因此rstR基因是區(qū)分和命名不同CTXΦ亞型的主要依據(jù)。O1血清群古典型菌株和El Tor型菌株的rstR序列分別稱為rstRclass和rstRET，兩者之間的序列差異很大，且相互之間沒(méi)有由rstR序列型介導(dǎo)的對(duì)相同CTXΦ超感染的免疫能力[6-7]。O139群菌株中的rstR大部分是rstRET[8], 后來(lái)，相繼發(fā)現(xiàn)了新的rstR序列型，如rstRcalc和rstR6[9-10]。除了攜帶ctxAB的CTXΦ外，在霍亂弧菌中還發(fā)現(xiàn)了不攜帶ctxAB的CTXΦ，命名為nct-CTXΦ[11]或pre-CTXΦ[12]。rstR也是pre-CTXΦ中變異最為明顯的基因[13-14]。除此之外，CTXΦ/pre-CTXΦ基因組在霍亂弧菌基因組中還具有多拷貝串聯(lián)的復(fù)雜形式，可整合至霍亂弧菌大、小染色體上[13-14]。

目前對(duì)O1群和O139群產(chǎn)毒霍亂弧菌中CTXΦ/pre-CTXΦ家族成員基因組的結(jié)構(gòu)和分布研究較多，但自環(huán)境中分離的不攜帶ctxAB的O1、O139群霍亂弧菌非產(chǎn)毒株同樣具有豐富的pre-CTXΦ家族及其基因組排列的多樣化[6-7, 13, 15-16]。后者基因組多態(tài)性也非常明顯[17]，其是否攜帶pre-CTXΦ的多樣性也值得關(guān)注。

對(duì)于霍亂弧菌中CTXΦ和pre-CTXΦ基因組的分析，不但可豐富這類溶源性的絲狀噬菌體分類及對(duì)霍亂弧菌中CTXΦ和pre-CTXΦ家族成員多樣性的認(rèn)識(shí)，也有助于研究產(chǎn)毒株的產(chǎn)生和新流行克隆群的形成。本研究中，我們篩選了4株攜帶pre-CTXΦ的O1和O139群霍亂弧菌，對(duì)其中的pre-CTXΦ進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和整合位點(diǎn)的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了O139群霍亂弧菌非產(chǎn)毒株中的pre-CTXΦ基因組明顯的序列型和排列多樣化，顯示出霍亂弧菌中該噬菌體家族的復(fù)雜進(jìn)化及對(duì)宿主感染和整合的復(fù)雜性。

1 材料與方法

1.1 菌株和染色體DNA提取

O139群霍亂弧菌菌株VC3741(序列號(hào)： SAMN11287978)、VC3193(序列號(hào)：SAMN11287980)、 VC702(序列號(hào)：SAMN11287979)和O1 群霍亂弧菌菌株VC1813(序列號(hào)：SAMN11287981)為本室保存。其中VC3741和VC3193分離于自然水體， VC702和VC1813分離于養(yǎng)殖牛蛙。4株霍亂弧菌均不攜帶霍亂毒素基因。菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，用Genomic Wizard試劑盒(Promega公司)按照說(shuō)明書(shū)提取菌株DNA。

1.2 基因組框架圖測(cè)定

使用Hyper Prep Kit( Kapa Biosystems公司, kk8504)構(gòu)建長(zhǎng)度為350 bp插入片段的DNA測(cè)序文庫(kù)。采用Illumina公司的Illumina HiSeqX Ten測(cè)序，雙端讀長(zhǎng)為150 bp。

1.3 基因組完成圖測(cè)定

構(gòu)建片段長(zhǎng)度>10 kb的測(cè)序文庫(kù)，使用PacBio RSII平臺(tái)進(jìn)行完成圖測(cè)定。

1.4 pre-CTXΦ基因組序列的獲取

從GenBank中下載所有霍亂弧菌的基因組數(shù)據(jù)，篩選沒(méi)有ctxAB但含有pre-CTXΦ的非產(chǎn)毒株。具體流程如下：通過(guò)Trimmomatic-0.38對(duì)原始reads數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制；使用SPAdes-3.11.1對(duì)質(zhì)控后的reads數(shù)據(jù)重新進(jìn)行組合；之后使用本地blast+比對(duì)查找ctxAB、tcpA和gⅢ序列；對(duì)于完成圖和只有組裝序列的基因組數(shù)據(jù)，直接使用本地blast+比對(duì)查找ctxAB、tcpA和gⅢ序列。如果某一個(gè)基因組中tcpA和gⅢ均為陽(yáng)性，且ctxAB基因?yàn)殛幮?，則認(rèn)為是攜帶pre-CTXΦ的基因組。共篩選到6株菌株的基因組符合條件，分別是TUC_VC849_07(O1群)、TUC_VC182_14(O1群)、TUC_Me3(非O1/非O139群)、2710(O1群)、2174(O1群)和2012EL-1759(非O1/非O139群)。

1.5 tcpA和gⅢ進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建及比較

使用muscle分別對(duì)tcpA和gⅢ的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，使用RAxML構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；再通過(guò)R語(yǔ)言treespace包比較兩者之間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 基因組測(cè)序及與產(chǎn)毒流行株的進(jìn)化關(guān)系

選擇4株具有pre-CTXΦ基因簇的非產(chǎn)毒株進(jìn)行了基因組測(cè)序，包括O1血清群中的3株(VC3193、VC3741和VC702)和O139血清群中的1株(VC1813)。在菌株VC1813和VC3193第2代測(cè)序的組裝結(jié)果中，pre-CTXΦ位于完整的contig中(表1)。而在菌株VC702和菌株VC3741第2代測(cè)序的組裝結(jié)果中，pre-CTXΦ位于多個(gè)contig中，未得到完整的pre-CTXΦ結(jié)構(gòu)。隨后我們利用PacBio RSⅡ系統(tǒng)，對(duì)VC702和VC3741的基因組進(jìn)行了第3代測(cè)序(長(zhǎng)讀長(zhǎng))，使用該測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組序列組裝，并使用第3代測(cè)序(短讀長(zhǎng))的結(jié)果進(jìn)行校正，最終獲得這2株菌的基因組完成圖(表2)。

表1 菌株VC1813和VC3193基因組2代測(cè)序的組裝結(jié)果

表2 菌株VC702和VC3741經(jīng)Illumina HiSeqX Ten和PacBio RSII系統(tǒng)測(cè)序并組裝的全基因組序列基本情況

Tab.2 Complete genomes of the strains VC702 and VC3741 sequenced and assembled by Illumina HiSeq X Ten and PacBio RSII

Strains(Serogroups)G+C%Chromosome1(bp)Chromosome2(bp)Plasmid(bp)Length(bp)AmountofplasmidVC702(O1)47.57314502310974653399842764861VC3741(O1)47.5230077951049053-40568480

為確定這些菌株與霍亂弧菌O1/O139群流行株及與其他血清群的遺傳學(xué)關(guān)系，我們選取了霍亂弧菌O1群(古典型和El Tor型)、O139群，以及非O1/非O139群共計(jì)44株基因組序列，其中O1群和O139群產(chǎn)毒株為1961年以來(lái)我國(guó)和其他國(guó)家流行的產(chǎn)毒株33株(圖1)。以O(shè)1群El Tor型霍亂弧菌產(chǎn)毒株N16961的基因組為參照，去除基因組中的重復(fù)片段區(qū)域以及重組片段區(qū)域,獲得核心基因組(core-genome)。核心基因組中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)共 18 500 個(gè)，利用這些SNPs并通過(guò)Neighbor Joining方法構(gòu)建了這些菌株基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖1)，顯示O1群El Tor型和O139群產(chǎn)毒株聚集形成了明顯的產(chǎn)毒菌株簇，其SNPs差異在80～280個(gè)；O1群古典型產(chǎn)毒株O395及其他群的非產(chǎn)毒株表現(xiàn)出明顯分化差異，其中O139群非產(chǎn)毒株VC1813和O1群非產(chǎn)毒株VC702、VC3193與O1群El Tor型產(chǎn)毒株SNPs差異數(shù)目達(dá)到 3 300～18 500 個(gè)。但菌株VC3741與O1群El Tor型產(chǎn)毒菌株簇聚集在一起，說(shuō)明該菌株與該流行菌株簇的基因組高度相似。數(shù)據(jù)表明在O1群和O139群的非產(chǎn)毒菌株中，盡管具有廣泛的基因組多樣化，但個(gè)別菌株也具有與大流行菌株相似的基因組背景。

The serogroups are marked in the brackets in the strain names. Non-toxigenic strain VC3741 was included within the cluster of the toxigenic O1 El Tor strains, which was shown in the box of dotted line. Strain O395 and the strains in this box, except for VC3741, arectxAB+, the others are allctxAB-.

圖1 4株非產(chǎn)毒株與霍亂弧菌O1/O139群流行株及與其他血清群的基因組進(jìn)化關(guān)系

Fig.1 The phylogenetic profile of the of the four V. cholerae strains compared with other toxigenic and non-toxigenic strains

2.2 4株非產(chǎn)毒菌株染色體上的pre-CTXΦ基因組結(jié)構(gòu)

利用組裝的4株研究菌株基因組序列，進(jìn)行pre-CTXΦ基因組識(shí)別，發(fā)現(xiàn)在VC3741、VC3193和VC1813大染色體上有pre-CTXΦ基因組，而在菌株VC702的大、小染色體上均有pre-CTXΦ基因組。鑒定各基因組的基因結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)及側(cè)翼的菌株染色體基因，得到以上菌株4個(gè)pre-CTXΦ基因組結(jié)構(gòu)(圖2)。

在菌株VC3741的基因組中，pre-CTXΦ整合在大染色體鄰近基因rtxA的dif1位點(diǎn)上，該位點(diǎn)是霍亂弧菌染色體I的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)雙拷貝二聚體最后解離的位點(diǎn), 而CTXΦ基因組利用該位點(diǎn)整合到霍亂弧菌染色體。它含有1個(gè)完整pre-CTXΦ基因組及前后各1個(gè)RS1結(jié)構(gòu)，該區(qū)域?yàn)椤癛S1-RS2-core region-RS1”形式。進(jìn)一步比對(duì)其rstR序列，發(fā)現(xiàn)pre-CTXΦ3741的rstR及下游RS1均為rstRET型，而其上游的RS1為rstR1型(相同序列的GenBank序列號(hào)：JX969003)。

菌株VC3193的pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側(cè)的dif1位點(diǎn)上，含有2個(gè)pre-CTXΦ基因組拷貝，無(wú)RS1結(jié)構(gòu)，此區(qū)域結(jié)構(gòu)為(RS2-core region)×2形式，2個(gè)拷貝的rstR序列相同，為rstRclass。該種前體以往出現(xiàn)在產(chǎn)毒株中，這是首次在非產(chǎn)毒株基因組中發(fā)現(xiàn)的。

菌株VC1813中pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側(cè)的dif2位點(diǎn)上。該前噬菌體中的rstR均為rstR232(GenBank序列號(hào)：DQ288668)，前噬菌體為pre-CTX232Φ，也是重復(fù)的雙拷貝，為(RS2-core region)×2形式。

在菌株VC702的大染色體中，pre-CTXΦ整合在基因rtxA旁側(cè)的dif1位點(diǎn)上，有串聯(lián)的2個(gè)相同拷貝，rstR序列型為rstZJ(相同序列的GenBank序列號(hào)：HM590227)，因此前噬菌體為pre-CTXZJΦ。其下游還含有1個(gè)RS1，rstR為rstR-5型(相同序列的GenBank序列號(hào)： AF133308)，該區(qū)域結(jié)構(gòu)為(RS2-core region)×2+RS1形式。在該菌的小染色體上，有RS1在VCA0569和VCA05702基因之間dif1位點(diǎn)上的整合，沒(méi)有pre-CTXΦ基因組。該區(qū)域?qū)嶋H有2個(gè)串聯(lián)的RS1，rstR序列型均為rstR-4**(相同序列的GenBank序列號(hào)：AF133307)。這種pre-CTXΦ及RS1(GenBank序列號(hào)：SRIL00000000)的染色體整合形式系首次報(bào)道。另外，在第2個(gè)RS1的rstA基因中插入一個(gè)轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)基因，分別編碼重組酶、甲硫氨酸抑制子樣蛋白、PIN 結(jié)構(gòu)域核酶和Tn3家族轉(zhuǎn)座酶。經(jīng)蛋白質(zhì)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些基因與來(lái)自肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)DA48896的質(zhì)粒p48896_2(GenBank序列號(hào)：CP024431.1)上4個(gè)編碼基因的序列一致性達(dá)99%。

圖2 4株非產(chǎn)毒株pre-CTXΦ及RS1基因組的染色體整合排列

Fig.2 Integrated genome arrangement of pre-CTXΦ and RS1 in the chromosomes of the strains used in this study

2.3 非產(chǎn)毒株pre-CTXΦ的受體識(shí)別蛋白PⅢ及所在菌株的感染受體TcpA序列的多樣性

CTXΦ中PⅢ的吸收結(jié)構(gòu)域(D2，134～252位氨基酸)能與TcpA的結(jié)構(gòu)和相關(guān)結(jié)構(gòu)域(SD_ID，121～191位氨基酸)相互作用，從而介導(dǎo)CTXΦ整合到細(xì)菌的染色體上[18]。但TcpA和PⅢ在不同菌株中序列可有所不同。進(jìn)一步分析4株菌株中TcpA及其pre-CTXΦ攜帶編碼的PⅢ的核苷酸和氨基酸序列。比較中還另外包括了9株霍亂弧菌：O1群El Tor型參考株N16961和O1群古典型參考株O395，非O1/非O139 群菌株TUC_Me3和2012EL-1759，O1群菌株TUC_VC182_14、TUC_VC849_07、2710、2174[19]及O139群菌株ICDC-VC661。相應(yīng)菌株的基因序列從GenBank中獲取，要求這些菌株同時(shí)具有CTXΦ/pre-CTXΦ以及完整tcpA基因序列，并盡可能包括較多血清群。對(duì)這些菌株的tcpA核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)化樹(shù)顯示(圖3)本研究中的VC3741和VC3193與第7次大流行的El Tor型菌株N16961序列相同，VC1813也與已測(cè)序發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)菌株序列相同，但VC702顯示了與所有菌株較大的差別，是一個(gè)新序列型。所有13株的TcpA氨基酸序列比較顯示，氨基酸序列差異主要出現(xiàn)在αβloop區(qū)以及D區(qū)[20]，在TcpA的結(jié)構(gòu)和相互作用結(jié)構(gòu)域(SD_ID)存在大量的變異位點(diǎn)(圖3)。在PⅢ的基因序列比對(duì)中(圖4)，發(fā)現(xiàn)菌株VC3741和VC1813的pre-CTXΦ分別為pre-CTXETΦ和pre-CTX232Φ，均與第7次大流行的O1群El Tor型菌株N16961中帶ctxAB毒素基因的CTXETΦ非常相似；菌株VC702的pre-CTXZJΦ中PⅢ的基因序列則比較獨(dú)特，為新的序列亞型；菌株VC3193中攜帶pre-CTXclassΦ，其PⅢ的基因序列更接近于O1群古典型菌株O395中攜帶的CTXclassΦ。氨基酸序列比較(圖4)顯示，氨基酸位點(diǎn)變異主要出現(xiàn)在D2區(qū)，該區(qū)是與TcpA相互作用的區(qū)域[18]。本研究中菌株VC3741、VC1813和VC702攜帶的3類pre-CTXΦ與El Tor型菌株N16961的基本相同，而VC3193與第6次大流行中的古典型菌株O395序列更為接近，但存在3個(gè)氨基酸殘基的差異，屬類古典型序列。

圖3 菌株tcpA基因序列進(jìn)化樹(shù)及蛋白氨基酸序列比對(duì)

Fig.3 Phylogenetic analysis (up) of thetcpAgenes and their amino acid sequence alignment (down) from the strains used in this study

圖4 菌株CTXΦ/pre-CTXΦ的gⅢ基因序列進(jìn)化樹(shù)及蛋白氨基酸序列比對(duì)

Fig.4 Phylogenetic analysis (up) of the CTXΦ/pre-CTXΦgⅢ genes and their amino acid sequence alignment (down) from the strains used in this study

3 討論

早先對(duì)霍亂弧菌大流行菌株攜帶CTXΦ的研究發(fā)現(xiàn)O1群El Tor型和O139群產(chǎn)毒株主要攜帶El Tor型的CTXΦ基因組。但目前在非產(chǎn)毒株中，發(fā)現(xiàn)了更多具有不同序列型的pre-CTXΦ以及基因組上復(fù)雜的整合排列方式。因此，CTXΦ/pre-CTXΦ實(shí)際上是一個(gè)具有多種序列型的復(fù)雜家族。本研究報(bào)道了pre-CTXΦ新的序列型以及在菌株染色體上的排列方式。

典型的CTXΦ基因組長(zhǎng)約7.2 kb，pre-CTXΦ長(zhǎng)約6 kb，另外RS1長(zhǎng)度約2.7 kb，這些序列還具有多拷貝串聯(lián)的復(fù)雜形式。因此，應(yīng)用第2代基因組測(cè)序難以組裝出結(jié)構(gòu)復(fù)雜的CTXΦ/pre-CTXΦ在染色體上的基因組排列。使用PCR確定基因間相互位置關(guān)系并通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建其基因組物理圖譜，將會(huì)涉及復(fù)雜的設(shè)計(jì)分析過(guò)程，且需要對(duì)多種可能組合進(jìn)行驗(yàn)證和排除。本研究則采用第3代基因組測(cè)序方法，基于PacBio平臺(tái)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序以及用短讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)π蛄羞M(jìn)行矯正和補(bǔ)充，得到了完整的pre-CTXΦ在菌株中整合位置和基因組排列信息，這顯示了基因組長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序以及整合高序列準(zhǔn)確性的短讀長(zhǎng)測(cè)序分析長(zhǎng)片段重復(fù)序列的優(yōu)勢(shì)。

產(chǎn)毒O1群El Tor型霍亂弧菌可引起全球流行，這類流行菌株攜帶的CTXΦ中，只檢測(cè)到3種rstR序列型，而rstRET是占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的型別，極少出現(xiàn)2種或以上rstR序列型的CTXΦ同時(shí)存在于1個(gè)菌株的情況[15, 19, 21]。多數(shù)O139群產(chǎn)毒株中CTXΦ的結(jié)構(gòu)也類似于El Tor型產(chǎn)毒株，但本研究也發(fā)現(xiàn)一些菌株中有較為復(fù)雜的CTXΦ/pre-CTXΦ整合形式，有的菌株CTXΦ/pre-CTXΦ共存且具有不同的rstR序列型[22]。4株不攜帶ctxAB的O1和O139群霍亂弧菌中，檢測(cè)到5種rstR序列型別，3株具有串聯(lián)雙拷貝的pre-CTXΦ基因組，另2株具有復(fù)雜多樣的RS1整合形式。這些RS1還具有多樣的rstR序列型，與O1群El Tor型產(chǎn)毒流行株明顯不同。非產(chǎn)毒株與產(chǎn)毒株基因組存在明顯差異，從目前分析看，其攜帶的pre-CTXΦ也具有多樣的序列型，即rstR序列多樣；而產(chǎn)毒的O1和O139群流行菌株相對(duì)單一，主要為El Tor型CTXΦ，pre-CTXΦ很少見(jiàn)。在菌株VC3193中，存在古典型CTXΦ的前體pre-CTXclassΦ?；魜y弧菌中攜帶毒素基因ctxAB的CTXΦ有CTXclassΦ、CTXETΦ 和CTXcalcΦ，后兩者均被報(bào)道攜帶ctxAB的其前體形式，但CTXclassΦ的前體pre-CTXclassΦ以往一直未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)的該基因組為第6次大流行的古典型菌株中CTXclassΦ的進(jìn)化來(lái)源找到了前體。另外，菌株VC3741屬于O1群非產(chǎn)毒株，在其基因組系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上與O1群El Tor型產(chǎn)毒株聚集在一起，而其攜帶的pre-CTXΦ屬于El Tor型，這可能提示具有與大流行菌株相似基因組的非產(chǎn)毒株也傾向于獲得El Tor型的CTXΦ/pre-CTXΦ。

多種rstR序列型出現(xiàn)在1個(gè)菌株中，說(shuō)明這些pre-CTXΦ和RS1具有相容性，即不同的rstR基因型產(chǎn)生的RstR蛋白不會(huì)對(duì)后來(lái)的噬菌體產(chǎn)生超感染的抑制，從而呈現(xiàn)了復(fù)雜的pre-CTXΦ/RS1基因組結(jié)構(gòu)形式。有意思的是，在單個(gè)菌株小染色體上發(fā)現(xiàn)與肺炎克雷白菌質(zhì)粒上序列一致的轉(zhuǎn)座成分也插入到其中1個(gè)RS1序列中，這說(shuō)明O139群環(huán)境菌株在自然環(huán)境中也發(fā)生跨種屬的基因水平轉(zhuǎn)移。

通過(guò)PⅢ的D2區(qū)與TcpA中的SD_ID區(qū)相互識(shí)別和結(jié)合，是CTXΦ/pre-CTXΦ感染霍亂弧菌的第一步。且不論在CTXΦ/pre-CTXΦ的PⅢ，還是在霍亂弧菌菌株TcpA及其相互作用結(jié)構(gòu)域，均發(fā)現(xiàn)了多種多樣的序列型。本研究中，我們通過(guò)對(duì)環(huán)境分離的O139群非產(chǎn)毒株基因組的分析，發(fā)現(xiàn)了還未曾報(bào)道的新的TcpA和PⅢ序列型，繼續(xù)豐富了霍亂弧菌中這類絲狀噬菌體及其受體的序列型。序列多樣性往往意味著對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性改變，可能是為適應(yīng)生存壓力而形成的。而CTXΦ/pre-CTXΦ中PⅢ與TcpA相互作用的D2區(qū)也有序列多樣化的現(xiàn)象，是否這些具有相互識(shí)別和相互作用的區(qū)域序列高變化有可能的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即PⅢ序列改變，能與不同TcpA序列型有不同的親和力，還需要分析精細(xì)的蛋白結(jié)構(gòu)域空間結(jié)構(gòu)及其相互作用能力才能明確。

CTXΦ的感染和基因組整合是產(chǎn)生霍亂弧菌新產(chǎn)毒株的重要機(jī)制。目前發(fā)現(xiàn)CTXΦ/pre-CTXΦ家族具有復(fù)雜多樣的成員。對(duì)這些具有不同rstR序列型成員及其霍亂弧菌基因組整合的研究，可認(rèn)識(shí)這類噬菌體基因組的多樣性和家族內(nèi)基因組重組與進(jìn)化等機(jī)制。更重要的是這些成員之間是否存在超感染的交叉免疫，尤其是當(dāng)pre-CTXΦ先感染一個(gè)菌株時(shí)，其是否能抑制攜帶霍亂毒素基因的同型和其他rstR序列型的CTXΦ再感染，即可能成為產(chǎn)毒株。因此，pre-CTXΦ在菌株中的整合，能夠在霍亂弧菌新產(chǎn)毒株產(chǎn)生上發(fā)揮影響作用。另外，不同PⅢ序列型的CTXΦ/pre-CTXΦ對(duì)不同TcpA序列型菌株的感染力是否有差異？?jī)烧唛g受體-配體的識(shí)別和相互作用特異性與能力決定了CTXΦ/pre-CTXΦ對(duì)不同遺傳背景菌株的感染力，這有待于進(jìn)一步的蛋白相互作用強(qiáng)度與特異性的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究。

總之，本研究利用第3代基因組測(cè)序(長(zhǎng)讀長(zhǎng))的優(yōu)勢(shì)，獲得了4株O1和O139群霍亂弧菌非產(chǎn)毒株中具有多拷貝重復(fù)長(zhǎng)片段的pre-CTXΦ基因組結(jié)構(gòu)，得到了前噬菌體pre-CTXΦ基因組及RS1基因組的排列圖譜，發(fā)現(xiàn)了新的pre-CTXΦ基因組及與RS1的排列組合形式。另外，結(jié)合對(duì)菌株與噬菌體的TcpA/PⅢ序列分析，展示了不同基因組進(jìn)化分支中霍亂弧菌中CTXΦ/pre-CTXΦ的感染及整合到宿主菌基因組的結(jié)構(gòu)多樣化，為研究這種具有自私特征的溶源性噬菌體的生存及攜帶毒素基因的CTXΦ在有和無(wú)pre-CTXΦ溶源化的霍亂弧菌中的傳播能力提供了更多的論據(jù)。