原發(fā)性痛風甲基化譜的研究

陳勇 李曉可 應穎 黃海燕 鄒榮鑫 褚贊波

痛風是單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）沉積在關節(jié)腔、腎臟、軟組織、軟骨等處所致的晶體相關性疾病，與嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關，臨床上主要表現(xiàn)為特征性急性關節(jié)炎。痛風可分為原發(fā)性痛風和繼發(fā)性痛風，原發(fā)性痛風目前病因尚未十分明確，通常認為是由遺傳因素和環(huán)境因素共同致病，原發(fā)性痛風具有一定的家族遺傳性，可能與多基因遺傳有關[1-2]。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基團，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，將胞嘧啶-磷酸-鳥苷酸（CpG）二核苷酸的胞嘧啶甲基化為5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一種化學反應[3]。研究表明，DNA甲基化在基因表達調(diào)控中的作用與腫瘤、衰老等相關。本研究通過對組間差異甲基化位點的分析，了解基因甲基化參與的生物學過程及調(diào)控的信號通路，探究與痛風之間的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年8月至2017年2月就診于中國科學院大學寧波華美醫(yī)院門診的3例原發(fā)性痛風患者作為痛風組，平均年齡33（33,44）歲，均為漢族男性、痛風初次發(fā)作，符合2015年ACR/EULAR制定的痛風診斷標準[4]，無長期降尿酸藥物使用史。選取同期體檢中心健康體檢者3例作為對照組，平均年齡43（39,44）歲，均為漢族男性，無痛風或高尿酸血癥家族史。兩組均排除其他風濕性疾病、癌癥、精神病、腎病病史，且均無血緣關系。本研究已通過中國科學院大學寧波華美醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取兩組研究對象空腹外周靜脈血2ml于EDTA管中，使用QIAamp DNA試劑盒（德國QIAGEN公司）提取全基因組DNA。吸取20μl蛋白酶K加入1.5ml干燥滅菌離心管底部，加入200μl血液，再加入200μl Buffer AL后混勻，56℃水浴鍋中孵育10min。轉(zhuǎn)移至離心柱并加入200μl的無水乙醇（96%～100%）混勻，6 000g 離心 1min；加入 500μl Buffer AW1，6 000g離心 1min；加入 500μl Buffer AW2，20 000g 離心 3min；離心柱置于另一2ml收集管上6 000g離心1min。最后將離心柱放置于1.5ml收集管中，加入100μl Buffer AE，室溫靜置 1min，6 000g離心 1min。封閉 1.5ml收集管，標記標本號。

1.2.2 DNA測定 采用核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度及純度，清潔測量臂并抽取3μl Buffer AE校準，抽取3μl DNA樣本置于下層測量底座上進行測量。DNA樣本吸光度 260/280，比值在 1.7～2.0，濃度 50～100ng/μl，總量＞1μg。

1.2.3 DNA 修飾 采用 Zymo EZ DNA Methylation Kit試劑盒（美國Zymo公司）對DNA進行亞硫酸鹽修飾。根據(jù)試劑盒說明準備試劑，抽取20μl DNA標本（濃度稀釋至 10～25ng/μl）及 130μl CT Conversion Reagent置于PCR管中混勻，并將 PCR管置于PCR儀中，在95℃30s、50℃1h條件中進行16個循環(huán)。在離心柱中加入600μl M-Binding Buffer及PCR樣本后離心；加入100μl M-Wash Buffer后＞10 000g離心30s；再加入200μl M-Desulphonation Buffer室溫放置15min后＞10 000g離心30s；加入200μl M-Wash Buffer后＞10 000g離心30s，操作2次；最后將離心柱置于1.5ml收集管上，加入 12μl M-Elution Buffer，轉(zhuǎn)速＞10 000g 離心 30s。

1.2.4 DNA擴增、斷裂、雜交 以下部分交由北京怡美通德科技發(fā)展有限公司完成并分析。使用PCR技術擴增后將DNA片段化，片段化的DNA沉淀回溶，與Methylation 850k基因芯片（美國Infinium公司）進行雜交。使用芯片掃描軟件iscan對芯片灰度掃描，掃描結(jié)果使用GenomestudioV2011（美國Illumina公司）進行分析。

1.2.5 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控 對每個樣品提供12 332個probe作為質(zhì)控項目，包括 Staining、Extension、Target Removal、Hybridization、Stringency、Non-sepecific Binding、Non-ploymorphic等，結(jié)果符合正常實驗的結(jié)果，芯片狀態(tài)正常。

1.3 數(shù)據(jù)處理 對芯片灰度進行掃描，可以得到芯片上每個甲基化點非甲基化探針和甲基化探針強度的原始信號值，經(jīng)過美國Illumina公司提供的方法進一步標準化，得到甲基化點的水平值（Avg_Beta），Detection Pval等。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用R2.15.0統(tǒng)計軟件。對差異CpG點進行聚類分析；對差異甲基化點所在的基因作Gene Ontology分析，并采用京都基因和基因百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析。Gene Ontology分析中進行 FDR 校正（FDR＜0.05）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 差異甲基化位點分析 痛風組與對照組相比，共有20 426個CpG位點甲基化水平發(fā)生改變，涉及10 063個基因，如 PTPRN2、MAD1L1、INPP5A、DIP2C、GNAS等。其中有5 719個高甲基化位點，14 707個低甲基化位點，低甲基化位點約占差異性位點的72%。其中參與嘌呤代謝的包括 POLE4、NME1-NME2、NME2、ITPA、PDE、ENTP6、APRT、ALLC 等。在差異性甲基化位點中隨機選取5 000個，對其水平值進行聚類分析（圖1，見插頁），發(fā)現(xiàn)痛風組較對照組存在更多的低甲基化位點，而對照組存在較多高甲基化位點。

2.2 Gene Ontology分析 隨機選取差異性甲基化CpG位點涉及的1 000個基因進行Gene Ontology分析，包括生物學過程（biological process，BP）（表 1）、細胞組成以及分子功能，結(jié)果按P值排序排列（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。參與的生物學過程主要為調(diào)控小GTPase介導的信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)形成、親同抗原的細胞黏附以及神經(jīng)元的分化等；細胞組成有13個，如細胞投射、細胞組成、突觸形成、細胞連接以及神經(jīng)元投射等；分子功能有18個，如蛋白結(jié)合、GTPase活性調(diào)控、核苷三磷酸活性調(diào)控、酶活性調(diào)控以及離子結(jié)合等。

2.3 Pathway分析 痛風組與對照組差異性甲基化CpG位點涉及的1 000個基因在KEGG映射中，有35個通路差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2），如磷酸酰肌醇信號系統(tǒng)、脂肪信號因子細胞通路、趨化因子細胞通路、Notch信號通路及FcγR介導的吞噬作用等。

表1 痛風組與對照組差異甲基化基因Gene Ontology分析

3 討論

DNA甲基化在不改變核苷酸序列的情況下使基因表達水平發(fā)生改變，從而產(chǎn)生可遺傳的表型，與人類疾病有著密切關系[5]。脊椎動物中，約半數(shù)基因在啟動子區(qū)上有著富含CG的序列，稱為CpG島。多種因素均可以影響含CpG島啟動子區(qū)的活性。CpG島上胞嘧啶C甲基化后，可以通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構等，進而起到抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用[6]。甲基化芯片可以進行高通量的分析，對少量基因組DNA進行快速檢測，從而進行分析基因的甲基化狀態(tài)。本研究通過甲基化芯片技術，對痛風患者及健康體檢者進行全基因組的分析，篩選出差異性甲基化位點，根據(jù)甲基化位點對相關基因參與的生物學過程、分子功能、細胞組成及信號通路進行分析，從而探究基因甲基化與痛風發(fā)病機制之間的關系。

表2 痛風組與對照組差異甲基化基因Pathway分析

基因異常甲基化與痛風的發(fā)展具有相關性，已有研究發(fā)現(xiàn)在痛風患者中，基因UMOD的甲基化水平明顯高于正常人[7]，而NRBP1的啟動子區(qū)呈低甲基化[8]，CCL2啟動子區(qū)的甲基化水平亦偏低[9]。通過聚類分析，筆者發(fā)現(xiàn)痛風組與對照組相比基因甲基化水平存在明顯差異，其中CpG低甲基化位點約占差異性位點的72%。同時發(fā)現(xiàn)與對照組相比，痛風組基因組中參與嘌呤代謝的基因，如POLE4、NME1-NME2、NME2等基因呈高甲基化，而ITPA、PDE、ENTP6、APRT等呈低甲基化狀態(tài)。其中，痛風組基因組中參與嘌呤代謝的PDE1C亦呈低甲基化狀態(tài)（P＜0.01），筆者認為這些基因的低甲基化可能增加基因表達，從而使嘌呤代謝產(chǎn)物一部分轉(zhuǎn)化為尿酸，引起體內(nèi)尿酸水平的升高。

尿酸沉積引起的痛風性關節(jié)炎與趨化因子引起的炎性級聯(lián)反應相關，尿酸鹽晶體可以激活NLRP3炎性體，引起IL-1β分泌，從而刺激中性粒細胞細胞的活化，使其釋放大量的促炎因子及趨化因子，在巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞及細胞因子等的作用下，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應[10]。Gene Ontology分析和Pathway分析顯示，痛風組與對照組相比，發(fā)生差異性甲基化基因參與的通路有趨化因子細胞通路、FcγR介導的吞噬作用、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路等炎性通路。筆者認為上述通路基因的差異性甲基化可以引起炎癥因子水平升高，可能與痛風性的急性發(fā)作有關。

尿酸是人體內(nèi)天然的抗氧化劑、自由基清除劑，對神經(jīng)系統(tǒng)可能具有一定的保護作用，研究發(fā)現(xiàn)，尿酸水平可能與帕金森病、阿爾茨海默病以及肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病相關[11-13]。在Gene Ontology和Pathway分析中，痛風組及對照組之間差異性甲基化基因分布參與了神經(jīng)系統(tǒng)的形成、發(fā)育以及突觸形成、神經(jīng)元投射等，還參與了膠質(zhì)瘤通路。根據(jù)本次研究結(jié)果，筆者認為痛風的發(fā)病與神經(jīng)系統(tǒng)疾病在基因水平上可能有聯(lián)系，但在此方面研究較少，需進一步研究探討。

此次研究樣本量較少，需要選取相關基因擴大樣本量進行驗證，從而為探討DNA甲基化在痛風發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。同時此次研究僅對痛風患者和健康體檢者基因的差異性甲基化進行了分析，沒有進行機體內(nèi)基因表達水平的測定，下一步可以對這些基因所表達的mRNA和蛋白質(zhì)進一步分析。