大鼠坐骨神經(jīng)離斷后細(xì)胞增殖、遷移與凋亡在近遠(yuǎn)端神經(jīng)片段的表達(dá)研究

姜 南，張志雄，李俊瑩，劉天戟

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

周圍神經(jīng)損傷所后，預(yù)后常不理想，肢體會(huì)留存不同程度的功能障礙，患者的身心受到莫大傷害，同時(shí)也給社會(huì)增加了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。目前，各種新型的人工生物組織神經(jīng)也已應(yīng)用于臨床，但效果仍不能取代自體神經(jīng)移植。究其原因，是由于周圍神經(jīng)損傷后病理生理變化受諸多因素影響，且在損傷神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端會(huì)呈現(xiàn)不同的變化。遠(yuǎn)端細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性凋亡，進(jìn)而神經(jīng)出現(xiàn)退行性變；近端神經(jīng)組織的抗凋亡信號(hào)會(huì)比較明顯，促進(jìn)沿?fù)p傷的軸突再生[2]。神經(jīng)損傷后再生速度緩慢，近遠(yuǎn)端具體變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)以及參與的主要調(diào)控因子，尚不完全明確，這些都對(duì)我們臨床工作中促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)有著莫大的影響[3]。本研究設(shè)計(jì)了大鼠坐骨神經(jīng)離斷的模型，利用基因芯片技術(shù)對(duì)其近遠(yuǎn)端基因所反映的細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析并加以對(duì)比，已期能找到疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸時(shí)期中的關(guān)鍵點(diǎn)，從而為臨床提供高效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及取材

健康成年SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重200±20 g，80只(10只備用)，進(jìn)行腹腔注射麻醉，采用復(fù)合麻醉劑(戊巴比妥鈉30 mg/kg)。麻醉生效后，無(wú)菌操作暴露右臀部，取縱行切口，分離臀大肌后，暴露坐骨神經(jīng)臀部走行長(zhǎng)約1 cm，于梨狀肌下緣行神經(jīng)橫斷，兩側(cè)均簡(jiǎn)單處理防止神經(jīng)再生自行接觸。無(wú)菌化處置創(chuàng)口后，大鼠飼養(yǎng)于24-30攝氏度，30-50%濕度的籠箱中，飲水及攝食自由，保證足夠時(shí)間光照。對(duì)照組不做任何處理。

取材：于擬定的每個(gè)時(shí)間點(diǎn):術(shù)后0天(即刻)，1天，3天，6天，9天，12天，15天各取大鼠10只，沿原切口分離進(jìn)入，取近端及遠(yuǎn)端神經(jīng)組織各0.3 cm，液氮凍存，以留實(shí)驗(yàn)用。

1.2 RNA提取和基因芯片分析

將取材所得的大骨坐骨神經(jīng)片段用于制備基因芯片，為減少異質(zhì)化，分析重復(fù)3次。

基因芯片制備：提取RNA并沉淀，測(cè)定RNA序列，分別合成第一鏈與第二鏈cDNA，并純化，用生物素標(biāo)記合成的cRNA，行純化并體外轉(zhuǎn)錄得到產(chǎn)物，分光光度計(jì)測(cè)定cRNA濃度，凝膠電泳檢測(cè)，然后片斷化cRNA，行分子探針雜交，洗脫和染色，最后得到基因數(shù)據(jù)。

基因篩選：根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同的基因比率，使用昂飛基因差異分析掃描系統(tǒng)進(jìn)行分析，對(duì)長(zhǎng)、短時(shí)間不同序列下的差異基因分別進(jìn)行表達(dá)趨勢(shì)的顯著性分析，差異性表達(dá)基因的篩選依據(jù)為P<0.05，fold change>2，得到整體差異基因的數(shù)量。

1.3 生物學(xué)進(jìn)程分析

我們應(yīng)用DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已經(jīng)篩選出來(lái)的差異基因進(jìn)行分析，通過(guò)Gene Ontology (GO)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。根據(jù)已知的周圍神經(jīng)損傷后再生的病理生理學(xué)特點(diǎn)，我們選出了細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡這3個(gè)生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)作為關(guān)鍵詞，對(duì)篩選基因的Entrez Gene ID號(hào)進(jìn)行分類分析，找到與之相對(duì)應(yīng)的基因，得到其在不同時(shí)間點(diǎn)的變化過(guò)程。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)分析

先行設(shè)計(jì)引物序列，利用不同時(shí)間點(diǎn)取材的神經(jīng)片段行總RNA的制備，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)擴(kuò)增，96wells Real-time PCR檢測(cè)。 為減少實(shí)驗(yàn)誤差，我們選取了內(nèi)參GAPDH對(duì)所有的目的基因進(jìn)行校正，在重復(fù)3次的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行δ配比進(jìn)行相對(duì)定量分析。在每個(gè)擬定的時(shí)間點(diǎn)，所篩選基因的表達(dá)水平與0天(即刻)進(jìn)行對(duì)比分析。本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS21.0 軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析處理，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為基因差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我們選取四個(gè)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡這3個(gè)生物學(xué)進(jìn)程的特異基因進(jìn)行驗(yàn)證，即Areg、Gdnf、Shh、Mal。雙調(diào)蛋白(Areg，Amphiregulin)是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員之一，在細(xì)胞的增殖，侵襲，轉(zhuǎn)移，神經(jīng)血管形成中發(fā)揮重要作用[4]。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Gdnf，glialcellline-derived neurotrophicfactor)一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在生理功能、受體、信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方面有著重要的作用[5]。音猬因子(Shh，Sonic Hedgehog)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，指導(dǎo)核內(nèi)因子轉(zhuǎn)錄，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖代謝的作用[6]。Mal基因的作用是編碼髓磷脂和淋巴細(xì)胞蛋白，其失活及異常與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、異型細(xì)胞的增殖凋亡等有一定關(guān)系[7]。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果

從差異基因表達(dá)的數(shù)量可以看出，在近側(cè)端神經(jīng)片段，細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移，差異基因的表達(dá)數(shù)量逐漸增高，在第6天和第9天之間達(dá)到高峰，即達(dá)到了神經(jīng)調(diào)控的高表達(dá)平臺(tái)；然后差異基因的表達(dá)數(shù)量逐漸下降，但仍處在一個(gè)相對(duì)較高的數(shù)量級(jí)，三者的整體趨勢(shì)基本一致(表1，圖1)。在遠(yuǎn)端神經(jīng)片段，細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移隨著時(shí)間的推移，差異基因的表達(dá)數(shù)量也是逐漸增高的，并且在第9天達(dá)到高峰，后呈下降趨勢(shì)，而細(xì)胞凋亡則全程表達(dá)逐漸增高，直到實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)第15天至最高峰。遠(yuǎn)端神經(jīng)片段差異基因表達(dá)的數(shù)量較近端占優(yōu)勢(shì)，尤其以細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡為主(表1，圖2)。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

我們篩選了四個(gè)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡這3個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)的特異基因進(jìn)行驗(yàn)證，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Areg、Gdnf、Shh、Mal這四個(gè)典型的細(xì)胞因子的基因芯片表達(dá)趨勢(shì)與分子生物學(xué)驗(yàn)證的RNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致(表2，圖3和4)。

表1 近端與遠(yuǎn)端神經(jīng)片段差異基因的表達(dá)數(shù)量

圖1 近端神經(jīng)片段差異基因數(shù)量柱狀圖

圖2 遠(yuǎn)端神經(jīng)片段差異基因數(shù)量柱狀圖

表2 近端與遠(yuǎn)端相關(guān)差異基因表達(dá)值

圖3 近端相關(guān)基因的RNA表達(dá)

圖4 遠(yuǎn)端相關(guān)基因的RNA表達(dá)

3 討論

神經(jīng)發(fā)生損傷后，巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬損傷細(xì)胞崩解成的碎片，為神經(jīng)再生創(chuàng)造合適的微環(huán)境，而雪旺細(xì)胞會(huì)發(fā)生分化并進(jìn)一步增殖以形成Bünger帶，其他分化形成的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)沿著其生長(zhǎng)形成新的神經(jīng)束。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后，位于不同位置雪旺細(xì)胞都會(huì)有不同表型的變化，在近端區(qū)域，隨著Bünger帶的形成，成熟的雪旺細(xì)胞會(huì)發(fā)生增殖和遷移，并附著于其上，結(jié)構(gòu)還未完全穩(wěn)定時(shí)，即向遠(yuǎn)端區(qū)域靶向生長(zhǎng)移動(dòng)，新生者并已有了神經(jīng)的相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能[8]。

在本研究中，近端神經(jīng)片段細(xì)胞增殖的差異基因數(shù)量呈升高趨勢(shì)，并在第6天到第9天達(dá)到頂峰，后略有下降。遠(yuǎn)側(cè)端差異基因的趨勢(shì)與其對(duì)應(yīng)相似，但整體數(shù)量較其明顯增多。從此可以看出，無(wú)論在近遠(yuǎn)端哪方面，細(xì)胞增殖都是一個(gè)高表達(dá)的因子系列，說(shuō)明其貫穿于整個(gè)神經(jīng)再生修復(fù)的始終。而在這里面，與雪旺細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖相關(guān)的基因在調(diào)控方面起到了主導(dǎo)作用[9]。

細(xì)胞遷移在整體趨勢(shì)方面，與細(xì)胞增殖近似。近端差異基因的數(shù)量逐漸增多，并在第6天至第9天達(dá)到達(dá)峰值，后開始下降；在遠(yuǎn)端方面，高峰同樣出現(xiàn)在第9天，而后呈下降趨勢(shì)。細(xì)胞遷移是生命體發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)，無(wú)論是正常增殖，異常創(chuàng)傷等造成的組織正常或異常形成，以及免疫趨化反應(yīng)，均需要特定細(xì)胞在特定信號(hào)因子的刺激介導(dǎo)下，朝特定部位定向移動(dòng)，且過(guò)程被精細(xì)調(diào)控[10]。神經(jīng)損傷后，對(duì)細(xì)胞遷移有調(diào)控功能的基因數(shù)量及表達(dá)水平在短期內(nèi)迅速增多，考慮它們可以在識(shí)別損傷信號(hào)后，調(diào)控中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等向損傷的部位迅速遷移，介導(dǎo)相關(guān)的炎癥與免疫反應(yīng)。在后期階段，一些特定介導(dǎo)細(xì)胞吞噬功能的基因除了參與細(xì)胞遷移，可同時(shí)清除細(xì)胞碎片，并在軸突導(dǎo)向生長(zhǎng)等方面起到協(xié)同的作用[11]。整體上來(lái)看，細(xì)胞遷移與細(xì)胞增殖的趨勢(shì)基本相同。不同在于早期階段，遠(yuǎn)側(cè)端細(xì)胞遷移表達(dá)較弱，說(shuō)明其早期刺激細(xì)胞遷移較弱，而分化吞噬作用起主導(dǎo)地位，為再生建立合適的內(nèi)環(huán)境，而后維持動(dòng)態(tài)平衡[12]。

在細(xì)胞凋亡方面，近側(cè)端差異基因呈顯著升高趨勢(shì)，在第6天至第9天維持相對(duì)高水平。與近側(cè)端結(jié)果不同，遠(yuǎn)側(cè)端差異基因在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中呈高表達(dá)狀態(tài)，并持續(xù)上升，在實(shí)驗(yàn)的最終日期15天達(dá)到最高。周圍神經(jīng)損傷后，遠(yuǎn)端組織會(huì)發(fā)生程序性退行性變，與此同時(shí)，損傷局部的抗凋亡信號(hào)會(huì)被激活。這種反饋性的保護(hù)作用在近遠(yuǎn)端程度不同，近端較明顯，而遠(yuǎn)端則凋亡信號(hào)占優(yōu)勢(shì)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與吞噬細(xì)胞清除碎片比較明顯，組織會(huì)發(fā)生全長(zhǎng)潰變[13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在神經(jīng)損傷后，大量的炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞在趨化作用下遷移到損傷局部，進(jìn)一步通過(guò)增殖作用以維持相關(guān)反應(yīng)的進(jìn)行。在這些作用下，增殖和凋亡這兩個(gè)相反的過(guò)程既相互對(duì)抗，又互相聯(lián)動(dòng)，達(dá)到了一個(gè)相對(duì)的平衡狀態(tài)[14]。遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)凋亡基因隨時(shí)間呈持續(xù)高表達(dá)，到達(dá)實(shí)驗(yàn)最遠(yuǎn)的時(shí)間兩周，說(shuō)明神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端失去了近側(cè)端的支配調(diào)控，已不能保持相對(duì)的平衡，凋亡占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這也闡明了Wallerian變性的真實(shí)特點(diǎn)[15]。

周圍神經(jīng)損傷后近遠(yuǎn)端會(huì)呈現(xiàn)不同趨勢(shì)的變化，這是由不同的細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控的，它們互相關(guān)聯(lián)，組成了一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)本研究，我們希望在周圍神經(jīng)損傷后再生分子調(diào)控的機(jī)制上，可以通過(guò)基因水平的深入研究，找到其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)，以便為臨床工作帶來(lái)新的契機(jī)。