氫氧化鋇處理-二氯甲烷萃取/GC-MS/MS檢測幾種水產(chǎn)品和加工肉制品中的7種N-亞硝胺

翟孟婷,王宗義,鄭 宇,候彤瑤,黃漫青

(1.北京農(nóng)學(xué)院,食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室,北京 102209)

N-亞硝胺是一類在食品加工和貯藏過程中由亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)作用形成的一類重要致癌性食品污染物[1-2]。目前,我國僅對N-亞硝基二甲胺(NDMA)在肉制品和水產(chǎn)動物性制品中的限量做出規(guī)定,分別為3和4 μg/kg[3],其他N-亞硝胺尚未限定。

食品中N-亞硝胺主要依賴色譜結(jié)合特異性高靈敏檢測器或質(zhì)譜進(jìn)行檢測,常見的檢測方有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[4-5]、氣相色譜-氮磷檢測器法(GC-NPD)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7-8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-12]。其中,GC-MS/MS和LC-MS/MS由于具有優(yōu)異的選擇性和靈敏度,近年來應(yīng)用報(bào)道較多,成為N-亞硝胺檢測的主要方法。但由于食品基質(zhì)復(fù)雜,目標(biāo)物含量低,改進(jìn)樣品前處理仍然是N-亞硝胺檢測方法研究的關(guān)鍵。檢測亞硝胺經(jīng)典樣品處理方法是水蒸氣蒸餾-液液萃取,也是現(xiàn)行國標(biāo)法[5]采用的方法,具有基質(zhì)效應(yīng)小、富集倍數(shù)大的特點(diǎn),但過程較長且有毒試劑用量大。改進(jìn)的方法主要有水蒸氣蒸餾-固相萃取[13]、分散液液微萃取[14-15]、分散固相萃取[16]和QuEChERS[9-10]等,或更為環(huán)境人員友好,或提高了檢測效率。本文以穩(wěn)定同位素標(biāo)記N-亞硝胺為內(nèi)標(biāo),通過氫氧化鋇皂化處理結(jié)合二氯甲烷單次萃取,以及適當(dāng)?shù)臉右簼饪s方法,建立一種簡便易行、相對成本較低的樣品處理方法,再結(jié)合GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性,實(shí)現(xiàn)對幾種加工肉制品和水產(chǎn)品中7種N-亞硝胺的有效檢測,并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚干(馬口魚、鲅魚、銀針魚、黃花魚、鳳尾魚、海燕魚)、蝦仁(金鉤、海米和紅蝦)和加工肉制品(午餐肉、廣味腸、臘肉、醬豬蹄、魚肉腸、培根、烤肉和熏腸) 北京回龍觀地區(qū)超市;氫氧化鋇(八水)、硫酸鈉 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二氯甲烷 色譜純,美國J.T.Baker公司;N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基二正丙胺(NDPA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2000 mg/L,1 mL) 美國o2si公司;NDMA-d6甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL)、NDPA-d14 甲醇溶液(1000 mg/L,1 mL)、NPYR-d8甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL) 美國Accustandard Inc公司。

Agilent 7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent Technologies公司;Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;IKA MS 3 basic渦旋混勻器 德國IKA公司;BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x 北京八方科技世紀(jì)有限公司;MJ-WBL2501B攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 將N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、3種定值穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)溶液,分別用二氯甲烷轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,得各N-亞硝胺濃度均為200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8濃度均為100 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備液,于棕色貯液瓶中-18 ℃儲存。用甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,得濃度分別為1、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液;用甲醇稀釋混合內(nèi)標(biāo)儲備液,得濃度1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液。用二氯甲烷稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液和內(nèi)標(biāo)溶液,得內(nèi)標(biāo)濃度為50 ng/mL,N-亞硝胺濃度分別為1、5、10、25、50和100 ng/mL系列混合工作液。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 皂化與萃取 取適量樣品,預(yù)切成約1 cm3的小塊,于樣品粉碎機(jī)中絞碎至粉或糜狀,稱取絞碎混勻樣品10 g于50 mL離心管中,加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,靜置5 min,加入3 g氫氧化鋇(八水),去離子水30 mL,渦旋1 min,擰緊蓋子于90 ℃烘箱處理2 h,取出10000 r/min離心10 min。將上清液傾入另一50 mL離心管,加入25 mL二氯甲烷,渦旋1 min后離心。棄去上層水溶液,下層二氯甲烷提取液通過盛有5 g無水硫酸鈉玻璃漏斗(底部放少量玻璃棉),收集于100 mL雞心瓶中,用5 mL二氯甲烷清洗離心管和無水硫酸鈉,合并二氯甲烷提取液于雞心瓶中。

1.2.2.2 濃縮方式的比較 采用旋蒸結(jié)合氮吹的方式進(jìn)行,對如下三種方式進(jìn)行比較:(a)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至5 mL,室溫氮吹至1 mL,待測;(b)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至干,用1 mL甲醇復(fù)溶,待測。(c)將25 mL提取液在35 ℃旋蒸至1 mL,室溫氮吹至近干,用1 mL甲醇復(fù)溶,待測。

1.2.3 色譜質(zhì)譜檢測

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:DB-WAXUI(30 m×250 μm×0. 25 μm);進(jìn)口樣溫度190 ℃,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL;載氣為氦氣,恒流模式,流量0.9 mL/min;程序升溫條件:35 ℃保持1 min,10 ℃/min升至90 ℃,30 ℃/min升至240 ℃保持6 min;傳輸線溫度:250 ℃。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊電離源(EI);電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;四級桿溫度:150 ℃;采集模式:多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),見表1;溶劑延遲:5 min。

表1 N-亞硝胺的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of N-nitrosamines

1.2.3.3 定性、定量分析 通過對目標(biāo)物保留時(shí)間、母離子及兩個二級離子響應(yīng)比值與標(biāo)樣相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行對照進(jìn)行定量;以目標(biāo)物相應(yīng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的濃度比(橫標(biāo))與相應(yīng)的響應(yīng)比為(縱標(biāo))進(jìn)行回歸,制作校正曲線,內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。NDMA、NMEA和NDEA以NDMA-d6為內(nèi)標(biāo),NDPA、NPIP以NDPA-d14為內(nèi)標(biāo),NPYR和NMOR以NPYR-d8為內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 對濃度范圍為1～100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,繪制校正曲線和計(jì)算R2值,評價(jià)線性關(guān)系;對實(shí)際樣品和加標(biāo)樣品的實(shí)際檢測,以各分析物的定量離子對信噪比(Peak to Peak)分別為3和10,且定性離子對色譜峰能夠被有效識別,評估檢出限和定量限。

1.2.4.2 準(zhǔn)確性與精密度 選取黃花魚干、金鉤蝦仁和午餐肉三個代表性樣品進(jìn)行三水平、六重復(fù)添加回收實(shí)驗(yàn),計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 樣品測定 應(yīng)用本方法檢測市售17種樣品,其中包括魚干6種、蝦仁3種和加工肉制品8種,每個樣品重復(fù)測定兩次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter workstation Acquisition/Qualitative/Quantitative Analysis Software Version B.07.04和Excel 2007進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離與質(zhì)譜檢測

中等極性和強(qiáng)極性毛細(xì)管柱均適用于N-亞硝胺的是分離[10,13],但就食品基質(zhì)而言,強(qiáng)極性柱優(yōu)勢較為明顯,NDMA不易受共流出物的干擾。本實(shí)驗(yàn)使用DB-WAXUI 柱,典型分離色譜圖如圖1所示,7種N-亞硝胺分離良好,NDMA與基質(zhì)中干擾物有效分離。質(zhì)譜MRM參數(shù),在參照樣品基質(zhì)干擾的情況下,對目標(biāo)物的前級離子、碎片離子進(jìn)行了選擇,對碰撞能進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果亦列于表1。

圖1 標(biāo)樣及樣品的MRM色譜圖

2.2 樣品前處理

2.2.1 皂化與萃取 研究表明,動物性食品中的脂肪可通過氫氧化鈉溶液皂化處理,使N-亞硝胺轉(zhuǎn)移至水溶液中[14-15,17],而氫氧化鋇溶解度小,降溫后迅速從溶液中析出,利于促進(jìn)離心分離,且分離液清澈、粘度低,更有利于后續(xù)進(jìn)一步活性炭固相萃取凈化[18-19],但氫氧化鋇用量超過1 g時(shí)容易析出堵塞小柱。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)[18]和[19]的基礎(chǔ)上,增加氫氧化鋇的用量至3 g,此時(shí)樣品溶液達(dá)到飽和非常有利于二氯甲烷的萃取;又由于動物性食品脂肪含量較高,適當(dāng)提高溫度和處理時(shí)間有利于加速脂肪的皂化,當(dāng)溫度為90 ℃,處理時(shí)間為2 h時(shí),樣液中的脂肪層消失,皂化完全。由于實(shí)際定量分析應(yīng)用的是目標(biāo)物與穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的濃度比,絕對提取量不影響定量結(jié)果,故離心后,上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中,經(jīng)二氯甲烷一次萃取,即可滿足檢測的需要,二氯甲烷用量減至經(jīng)典法的十分之一。又由于整個處理在50 mL離心管中進(jìn)行,僅需兩次離心、一次樣液轉(zhuǎn)移,即可完成皂化與萃取,使得方法較為簡單,有利于多個樣品的批量處理。

2.2.2 濃縮方式的比較 文獻(xiàn)報(bào)道[20]和本實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)N-亞硝胺在減壓濃縮和氮吹過程中容易發(fā)生損失,為優(yōu)化濃縮方法,本實(shí)驗(yàn)對濃縮方式進(jìn)行了考察,設(shè)計(jì)的3種濃縮方式的比較結(jié)果見圖2。方式(a)的各目標(biāo)物峰面積與參照標(biāo)樣對應(yīng)峰面積的比值均高于其他兩種方法,效果最佳。方式(b),即旋蒸至盡干,方式(c),即氮吹至盡干,都會使NDMA、NMEA等相對分子質(zhì)量較小的目標(biāo)物損失嚴(yán)重;而方式(b)和(c)的對比結(jié)果表明樣品基質(zhì)存在下,各目標(biāo)物氮吹至盡干均較旋蒸至盡干目標(biāo)物損失少,且相對分子質(zhì)量越小損失越大。使用甲醇復(fù)溶樣品,樣液清亮,可進(jìn)一步去除脂溶性物質(zhì),減小基質(zhì)效應(yīng),但需要對二氯甲烷進(jìn)行蒸干,造成目標(biāo)物過度損失。綜合上述,本實(shí)驗(yàn)選擇方式(a)進(jìn)行濃縮,即旋蒸至5 mL,氮吹至1 mL。

圖2 濃縮過程對7種N-亞硝胺含量的影響

2.3 線性關(guān)系、檢出限、定量限

根據(jù)實(shí)際樣品的含量,對濃度范圍為1～100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行考察,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2均大于0.999。檢出限和定量限則根據(jù)實(shí)際樣品和加標(biāo)樣品各分析物的定量離子對信噪比(Peak to Peak)分別為3和10且定性離子對色譜峰能夠被有效識別、評估而得,分別為0.08～0.23、0.25～0.76 μg/kg。線性方程、檢出限和定量限詳見表2,參照肉制品和水產(chǎn)制品中NDMA的限量規(guī)定為3和4 μg/kg,該方法的檢出限、定量限能夠滿足動物性食品中N-亞硝胺檢測的需要。

表2 各化合物的線性方程、檢出限和定量限Table 2 Regression equations,limits of detection and limits of quantification for the compounds

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

選取黃花魚、金鉤蝦仁和午餐肉三個代表性樣品進(jìn)行三水平(n=6)添加回收實(shí)驗(yàn),根據(jù)樣品中N-亞硝胺的含量情況,設(shè)置兩組添加水平(見表3),7種N-亞硝胺的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為71.6%～133.8%和2.04%～17.1%(亦見表3)。

表3 樣品中7種揮發(fā)性N-亞硝胺的回收率及精密度(n=6)Table 3 The recoveries and precision of seven volatile N-nitrosamines(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法檢測市場上6種魚干,3種干制蝦仁和8種加工肉制品,每個樣品重復(fù)測定兩次,結(jié)果列于表4。魚蝦樣品中NDPA的檢出率為100%,NDMA的檢出率為88.9%，檢出最高值為2.59 μg/kg;加工肉制品中NPYR和NDMA檢出率為100%,NDMA含量范圍在

表4 實(shí)際樣品中7種N-亞硝胺含量Table 4 Contents of seven N-nitrosamines in actual samples

3 結(jié)論

本文建立了以穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo),氫氧化鋇處理結(jié)合二氯甲烷萃取,GC-MS/MS檢測幾種水產(chǎn)品和加工肉制品中7種N-亞硝胺的新方法。氫氧化鋇加熱處理能有效去除樣品中的脂肪,結(jié)合二氯甲烷單次離心管中萃取,有效簡化了樣品處理方法。方法在考察的濃度范圍內(nèi)(1～100 ng/mL)表現(xiàn)良好線性,R2均大于0.999,回收率為71.6%～133.8%,RSD為2.04%～17.1%。該方法簡便易行、相對成本低,有毒試劑用量小,選擇性好,有足夠的檢出限,能夠滿足魚干、蝦仁等水產(chǎn)品和午餐肉、香腸等加工肉制品中7種N-亞硝胺檢測的需要。