益生菌山藥飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化及其冷藏穩(wěn)定性

黃 天,韓之皓,郭 帥,鄭 巖,王月嬌,白 梅,王記成,孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

山藥又稱薯蕷,為薯蕷蔓性植物的塊莖[1],其性甘、平、無毒,常食之可強健身體,有助于消化[2]。 山藥中含淀粉、人體必需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素和皂甙黏液質(zhì)等營養(yǎng)成分[3]。

作為傳統(tǒng)的藥食同源食品,對山藥的加工利用一直是人們研究的重點[4]。山藥經(jīng)糖化酶糖化后接種益生菌發(fā)酵可加工成具有益生作用的發(fā)酵食品。益生菌發(fā)酵作用既提高了制品的營養(yǎng)價值為制品增加了益生特性,又改善了產(chǎn)品的風(fēng)味、口感[5]。研究開發(fā)益生菌發(fā)酵山藥飲料,不僅增加了國內(nèi)乳酸菌飲品種類,也為山藥綜合開發(fā)利用提供了新的途徑。

近年來山藥發(fā)酵飲料在國內(nèi)的研究開發(fā)上,大部分都集中在復(fù)合型山藥發(fā)酵飲料、山藥發(fā)酵乳以及山藥發(fā)酵醋的應(yīng)用上[6-8]。盧霖等[9]以薏米、山藥為主要原料,通過對發(fā)酵工藝條件進行研究,制備出口感柔和細膩、滑潤爽口、米香豆香純正的薏米山藥乳酸飲料;高晗等[10]對山藥發(fā)酵乳工藝配方進行優(yōu)化,制備出口感細膩、組織均勻且凝固性好,富有濃郁的山藥香氣的山藥發(fā)酵乳。國外對山藥的研究主要集中在有效成分上,發(fā)酵飲料相關(guān)文獻鮮有[11]。

本研究以山藥粉為原料,以益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9為發(fā)酵劑發(fā)酵山藥飲料,將益生菌與山藥結(jié)合,開發(fā)一種兼具山藥的營養(yǎng)價值及益生菌益生功能的益生菌山藥飲料。目前國內(nèi)市場還未有以山藥為原料制成的發(fā)酵型活菌飲料,因此具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用L.plantarumP-8和B.lactisV9直投式發(fā)酵劑 均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種庫提供;山藥粉 購自河南省焦作縣;耐高溫a-淀粉酶(酶活18萬U/g)、糖化酶(酶活26U/g) 購自滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;vortex-genie2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司;HA-300M全自動高壓蒸汽滅菌器 日本HIRAYAMA公司;pHS-3C 型pH計 上海雷磁儀器廠;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SRH高壓均質(zhì)機 上海申鹿均質(zhì)機有限公司;SJ-CJ-2FDQ超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 益生菌山藥飲料制作流程 將山藥粉和水按1∶7料水比混合均勻,在25 MPa下均質(zhì)后升溫至90 ℃添加耐高溫a-淀粉酶(酶添加量0.2%,酶解pH6.5)進行液化工藝,酶解60 min后冷卻至60 ℃添加糖化酶(酶添加量0.2%,酶解pH4.4)進行糖化工藝,以碘比色法判斷山藥淀粉水解是否完全[12]。酶解完全后升溫至95 ℃,進行95 ℃ 300 s滅酶后冷卻至37 ℃(得到酶解山藥漿)進行接菌(接種量2×106CFU/mL),恒溫發(fā)酵18 h后終止發(fā)酵并進行調(diào)配,在25 MPa下均質(zhì)后進行罐裝,最終得到益生菌山藥飲料成品。

1.2.2 益生菌山藥飲料發(fā)酵條件單因素實驗

1.2.2.1 發(fā)酵時間的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復(fù)配,以2×106CFU/mL接種量接種至酶解山藥漿中,37 ℃分別發(fā)酵0、3、6、9、12、15、18、21、24 h,以活菌數(shù)、滴定酸度和pH為評價指標(biāo),確定合適的發(fā)酵時間。

1.2.2.2 接種量的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復(fù)配,分別按1×106、2×106、3×106、4×106、5×106CFU/mL的接種量接種至酶解山藥漿中37 ℃發(fā)酵至1.2.2.1確定的發(fā)酵時間,以活菌數(shù)、滴定酸度和pH為評價指標(biāo),確定合適的接種量。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度的確定 將益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復(fù)配,以1.2.2.2節(jié)確定的接種量接種至酶解山藥漿中,分別在33、35、37、39、41 ℃下發(fā)酵至1.2.2.1確定的發(fā)酵時間,以活菌數(shù)、滴定酸度和pH為評價指標(biāo),確定合適的發(fā)酵溫度。

1.2.3 益生菌山藥飲料發(fā)酵條件響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗 根據(jù)響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6 Trial中Response surface選項卡下Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用3因素3水平的響應(yīng)曲面分析方法。pH是指溶液中氫離子的總數(shù)和總物質(zhì)的量的比,滴定酸度是指溶液中能與強堿發(fā)生中和作用的物質(zhì)的總量。因此滴定酸度比pH更能代表發(fā)酵過程中酸度的變化,故確定酶解山藥漿活菌數(shù)和滴定酸度為響應(yīng)值,以接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為自變量,分別以A、B、C表示,并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。試驗因素水平及編碼見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface expcriment

1.3 益生菌山藥飲料貯藏試驗

將發(fā)酵后酶解山藥漿進行調(diào)配、均質(zhì)后得到益生菌山藥飲料成品,對其進行貯藏試驗。樣品于4 ℃下貯藏28 d,每隔7 d取樣,測定樣品的pH、滴定酸度和活菌數(shù),并對樣品進行感官評定。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 pH的測定 采用雷磁 pH S-3C型pH計測定。

1.4.2 滴定酸度的測定 益生菌山藥飲料的滴定酸度按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009-239-2016中規(guī)定的“酚酞指示劑法”進行檢測[13]。

1.4.3 活菌數(shù)的測定 將益生菌山藥飲料取樣進行梯度稀釋,采用MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)測定活菌數(shù)[14]。

1.5 發(fā)酵山藥飲料樣品感官評定

貯藏期間,每隔14 d對益生菌山藥飲料貯藏樣品進行一次感官評定。感官評定小組由10名評定人員組成,10名評定人員經(jīng)常飲用活性乳酸菌飲料且全部為食品專業(yè)學(xué)生,并接受兩次兩小時的評鑒培訓(xùn)[15]。評分采用100分制[16],具體感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 飲料感官評定方案Table 3 Evaluate method of sensory of beverage

1.6 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)均以平均值表示。實驗圖表采用Origin Pro繪制,響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌山藥飲料發(fā)酵條件單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵時間的確定 酶解山藥漿在發(fā)酵過程中活菌數(shù)、滴定酸度和pH隨時間變化測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時間對酶解山藥漿活菌數(shù)、滴定酸度和pH的影響

由圖1可知,在接種量和發(fā)酵溫度一定的情況下,酶解山藥漿活菌數(shù)隨發(fā)酵時間延長呈不斷上升趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間達18 h后,隨發(fā)酵時間的延長活菌數(shù)變化不顯著,說明18 h后益生菌生長已經(jīng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

隨發(fā)酵時間的延長,酶解山藥漿pH不斷下降,滴定酸度不斷上升。這是由于在發(fā)酵過程中,益生菌不斷利用發(fā)酵基質(zhì)中的糖類產(chǎn)酸,使乳酸累積,酸度上升[17]。當(dāng)發(fā)酵時間達18 h后,隨發(fā)酵時間延長滴定酸度略有增加,基本呈平緩趨勢;pH隨發(fā)酵時間的延長無顯著變化,此時pH達到3.85左右,與唐維媛等[18]的研究結(jié)果有相似之處。

益生菌發(fā)酵產(chǎn)酸量及發(fā)酵的完全程度會受到發(fā)酵時間的直接影響。發(fā)酵時間過長,產(chǎn)酸量大,酸度過低;發(fā)酵時間過短,發(fā)酵進行不完全[19]。復(fù)合益生菌發(fā)酵不僅可提高活菌數(shù),還可對產(chǎn)品的酸度和風(fēng)味等產(chǎn)生積極影響。綜合發(fā)酵時間對活菌數(shù)、滴定酸度及pH的影響結(jié)果,確定適宜的發(fā)酵時間約為18 h。

2.1.2 接種量的確定 酶解山藥漿在不同接種量下37 ℃恒溫發(fā)酵18 h后活菌數(shù)和酸度測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對酶解山藥漿活菌數(shù)、滴定酸度和pH的影響

由圖2可知,在發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間相同的情況下,不同接種量的酶解山藥漿在發(fā)酵終止時活菌數(shù)隨接種量增大呈逐漸上升的變化趨勢。當(dāng)接種量高于2×106CFU/mL后,隨接種量增大活菌數(shù)上升趨勢無顯著變化。說明當(dāng)接種量為2×106CFU/mL時,此時底物濃度與益生菌的比例接近最佳,增加接種量對活菌數(shù)增長沒有明顯變化。

發(fā)酵終止時酶解山藥漿pH隨接種量增大呈逐漸下降的變化趨勢。當(dāng)接種量高于2×106CFU/mL后,pH下降趨勢不顯著。

發(fā)酵終止時酶解山藥漿滴定酸度隨接種量增大呈逐漸上升的變化趨勢。當(dāng)接種量高于2×106CFU/mL后,滴定酸度上升趨勢隨接種量增大變化不顯著,與發(fā)酵終止時活菌數(shù)的增長趨勢相符合。

發(fā)酵劑接種量不僅對酶解山藥漿活菌數(shù)和酸度產(chǎn)生直接影響,對發(fā)酵結(jié)束后飲料的口感及風(fēng)味也起到?jīng)Q定性作用。接種量過小,產(chǎn)酸速率慢,發(fā)酵時間延長;接種量過大,產(chǎn)酸速率快,發(fā)酵前期酸度上升過快導(dǎo)致發(fā)酵后飲料風(fēng)味變差[20]。綜合接種量對活菌數(shù)、滴定酸度及pH的影響結(jié)果,確定L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1復(fù)配發(fā)酵酶解山藥漿的適宜接種量約為2×106CFU/mL。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定 不同溫度下分別恒溫發(fā)酵18 h后酶解山藥漿活菌數(shù)和酸度測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對酶解山藥漿活菌數(shù)、滴定酸度和pH的影響

由圖3可知,在接種量和發(fā)酵時間相同的情況下,不同發(fā)酵溫度下的酶解山藥漿在發(fā)酵終止時活菌數(shù)隨發(fā)酵溫度升高呈先增大后減小的變化趨勢。發(fā)酵溫度過低或過高均會抑制益生菌的生長,導(dǎo)致產(chǎn)品活菌數(shù)下降,從而影響產(chǎn)酸能力[21]。當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時,由于發(fā)酵溫度較低,導(dǎo)致代謝不活躍,影響活菌數(shù)的增長;當(dāng)發(fā)酵溫度為41 ℃時,可能是由于發(fā)酵溫度較高,菌體生長較慢,導(dǎo)致活菌數(shù)下降。

酶解山藥漿pH隨發(fā)酵溫度升高呈先下降后上升的變化趨勢,滴定酸度隨發(fā)酵溫度升高呈先上升后下降的變化趨勢。pH和滴定酸度變化與活菌數(shù)變化相符合。益生菌生長會受到發(fā)酵溫度的影響,進而影響發(fā)酵的速度及發(fā)酵過程中乳酸的積累[22]。綜合發(fā)酵溫度對活菌數(shù)、滴定酸度及pH的影響,確定適宜發(fā)酵溫度約為37 ℃。

2.2 益生菌山藥飲料發(fā)酵條件響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗

響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵益生菌山藥飲料生產(chǎn)工藝的試驗結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果Table 4 Results of response surface optimization test

通過Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,分別得到滴定酸度和活菌數(shù)對接種量(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵溫度(C)的二次多元回歸方程為:

Y1=107.36+0.97A+3.00B-0.98C-1.16AB-1.45AC-1.16BC-7.94A2-6.84B2-0.46C2

Y2=8.65-0.005A+0.088B+0.012C+AB+0.025AC-0.060BC-0.097A2-0.12B2-0.16C2

對滴定酸度和活菌數(shù)兩個模型進行方差分析,結(jié)果見表5。

表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Regression model coefficient significance test

根據(jù)回歸方程,作響應(yīng)面圖及等高線圖,結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度對滴定酸度影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖5 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對滴定酸度影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖6 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對活菌數(shù)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖4顯示,隨接種量增加,滴定酸度呈先增大后減小的趨勢,接種量和發(fā)酵溫度對滴定酸度影響的響應(yīng)面坡度比較陡峭,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明接種量和發(fā)酵溫度之間的交互作用對滴定酸度的影響顯著。

圖5顯示,隨發(fā)酵時間延長,滴定酸度呈先增大后減小的趨勢,發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對滴定酸度影響的響應(yīng)面坡度比較陡峭,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度之間的交互作用。

圖6顯示活菌數(shù)隨發(fā)酵溫度升高和發(fā)酵時間延長,呈先增大后減小的趨勢。發(fā)酵溫度和發(fā)酵活菌數(shù)的影響響應(yīng)面坡度陡峭程度明顯,等高線排列較緊密且呈橢圓形,說明發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間之間的交互作用對活菌數(shù)的影響顯著,此表現(xiàn)與模型得出p值一致。

通過上述回歸模型,采用響應(yīng)面分析優(yōu)化后獲得益生菌山藥飲料最佳發(fā)酵工藝條件為:2.02×106CFU/mL、發(fā)酵時間為19.10 h、發(fā)酵溫度為36.96 ℃。在該工藝條件下,益生菌山藥飲料活菌數(shù)理論值可達8.66lg CFU/mL,滴定酸度理論值可達107.53 °T。考慮到實際生產(chǎn)操作,將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為:接種量2×106CFU/mL、發(fā)酵時間19.1 h、發(fā)酵溫度37 ℃。在調(diào)整過后所得最佳發(fā)酵工藝條件下對其進行驗證試驗,試驗重復(fù)三次并取平均值,得出結(jié)果測得益生菌山藥飲料的實際活菌數(shù)為4.3×108CFU/mL,滴定酸度為105.33 °T,與模型預(yù)測值較為吻合,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的益生菌山藥飲料發(fā)酵工藝條件準(zhǔn)確可靠,可用于實際操作。

2.3 益生菌山藥飲料的冷藏穩(wěn)定性

2.3.1 活菌數(shù)和酸度的變化 由表7可以看出,pH在4 ℃貯藏28 d期間均保持在3.71±0.10范圍內(nèi)不變;滴定酸度在4 ℃貯藏28 d期間隨貯藏天數(shù)增加不斷升高;樣品中益生菌總活菌數(shù)在4 ℃貯藏28 d期間始終穩(wěn)定在 108CFU/mL以上,28 d時最低,約為3.43×108CFU/mL。該飲料樣品在貯藏期內(nèi)滴定酸度及活菌數(shù)變化規(guī)律與陳世賢等研究相符合[23]。

表7 益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28 d貯藏期內(nèi)活菌數(shù)、pH及滴定酸度的變化Table 7 Changes of viable bacteria counts and acidity of probiotic yam beverage samples during storage at 4 ℃ for 28 days

2.3.2 感官品質(zhì)的變化 由圖7可知,益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28 d貯藏期內(nèi)飲料色澤始終保持淡黃,且澄清透明;飲料組織狀態(tài)良好,始終無分層現(xiàn)象;貯藏結(jié)束時飲料乳酸菌飲料特有的風(fēng)味明顯;隨著貯藏時間的增加,酸度有所上升,但綜合口感仍在可接受范圍之內(nèi)。綜上所述,益生菌山藥飲料在貯藏期內(nèi)組織狀態(tài)良好、風(fēng)味及口感穩(wěn)定。

圖7 益生菌山藥飲料樣品在4 ℃、28d貯藏期內(nèi)感官評價

3 結(jié)論

以山藥粉為原料,通過接種益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9進行發(fā)酵,研究發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度對益生菌山藥飲料中活菌數(shù)、滴定酸度以及pH的影響,在此基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化,通過分析優(yōu)化得出發(fā)酵時間對發(fā)酵山藥飲料滴定酸度及活菌數(shù)影響最大。經(jīng)回歸分析并結(jié)合實際生產(chǎn)操作可行性后確定發(fā)酵益生菌山藥飲料最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件為接種量2×106CFU/mL、發(fā)酵時間19.1 h、發(fā)酵溫度37 ℃,在此條件下益生菌山藥飲料活菌數(shù)為4.3×108CFU/mL,滴定酸度為105.3 °T。對益生菌山藥飲料進行4 ℃、28 d貯藏實驗,結(jié)果表明:pH在4 ℃貯藏28 d期間均保持在3.71±0.1范圍內(nèi),與目前市售的活性乳酸菌飲料pH無顯著性差異;貯藏期間飲料益生菌總活菌數(shù)基本維持在108CFU/mL,且貯藏結(jié)束后飲料組織狀態(tài)穩(wěn)定,質(zhì)地保持均勻,無沉淀及分層現(xiàn)象。在此條件下發(fā)酵后制得益生菌山藥飲料色澤淡黃,澄清透明,且香氣濃郁、口感清爽,是一種兼具豐富營養(yǎng)價值與良好益生功能的活性益生菌飲料,具有良好的開發(fā)前景。