響應面-主成分分析法優(yōu)化仙人掌發(fā)酵酒工藝

肖世娣,王 菁,薛逸軒,張惠玲

(寧夏食品微生物應用技術(shù)與安全控制重點實驗室,寧夏大學,寧夏銀川 750021)

米邦塔食用仙人掌不僅營養(yǎng)豐富,而且具有較高的藥用價值,富含豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、纖維素[1]和維生素C等,并含有多種活性功能成分,如黃酮、多糖、生物堿等[2]。米邦塔食用仙人掌具有較高的藥用價值,能夠抗病毒、抗炎、抗糖尿病(II型)、以及抗高脂血癥和高膽固醇血癥[3],1998年被我國農(nóng)業(yè)部作為一種蔬菜引入國內(nèi)[4],至今寧夏吳忠成為其全國種植面積最大的種植基地。

我國對仙人掌的研究較少,主要集中在仙人掌片活性物質(zhì)方面,例如黃酮的提取工藝[5]、抗炎功效[6]、仙人掌多糖的組成成分[7]、提取工藝及抗炎功效[8]等。國外仙人掌的食用主要是鮮食[9],在我國還未廣泛推廣,以仙人掌片作為原料發(fā)酵成酒研究也甚少。本研究以黃酮、總酚物質(zhì)為指標,優(yōu)化發(fā)酵工藝,以最大程度地保留仙人掌有效成分,釀制出清香、營養(yǎng)健康、具有仙人掌典型風格的發(fā)酵型酒仙人掌酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米邦塔食用仙人掌片(寧夏吳忠仙人掌種植基地)、酵母Excellence FTH-卓越 FTH 寧夏諾盟集團有限公司;降粘用酶 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;亞硫酸(食品級) 寧夏偉民生物有限公司;蔗糖 新百超市(寧陽店)。

LDZX-40C型自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器 北京恒奧德儀器儀表有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;PHS-2C數(shù)顯酸度計 杭州奧利龍儀器有限公司;LRH-150B型恒溫培養(yǎng)箱 廣東泰宏君科學儀器股份有限公司;RZ-988T型打漿機 深圳五聯(lián)通達科技有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;UV2000紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙人掌發(fā)酵酒釀造工藝流程

操作要點:選擇新鮮無腐爛變質(zhì)的仙人掌清洗后去刺,流動清水漂洗2次,備用。將清洗好的仙人掌根據(jù)料水比要求稱量,切成2 cm長的塊,置于打漿機中,按照設定料水比的不同,加水混合打漿得仙人掌漿。通過預實驗獲得最佳降粘酶的用量為0.5%,通過降粘酶使仙人掌汁在45 ℃水浴酶解3 h后在50 ℃水浴酶解2 h,測得仙人掌汁的可溶性固形物為0.5%～1%,pH為4～4.5。根據(jù)仙人掌發(fā)酵酒酒精度的要求,用蔗糖調(diào)整到要求。用20%檸檬酸調(diào)酸至酵母適宜生長pH為3.5。稱取所需用量的酵母,加入10倍的無菌水,在37 ℃的條件下活化30 min,接種發(fā)酵。每天手動攪拌排氣2次,直至基本無氣泡產(chǎn)生,發(fā)酵結(jié)束過濾澄清,獲得仙人掌發(fā)酵酒。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料水比對仙人掌酒發(fā)酵的影響 通過預實驗確定的單因素實驗基本條件為:發(fā)酵溫度20 ℃、初始糖度25%、酵母接種量0.05%,料水比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7進行接種發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束測定黃酮與總酚含量。

1.2.2.2 酵母接種量對仙人掌酒發(fā)酵的影響 確定料水比1∶4、發(fā)酵溫度20 ℃、初始糖度25%,酵母接種量分別為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%進行接種發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束測定總酚和黃酮含量,并進行感官評價。

1.2.2.3 初始糖度對仙人掌酒發(fā)酵的影響 確定料水比1∶4、酵母接種量0.05%、發(fā)酵溫度20 ℃,初始糖度分別為15%、20%、25%、30%、35%進行接種發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束測定酒精度和黃酮、總酚含量。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度對仙人掌酒發(fā)酵的影響 確定料水比1∶4、酵母接種量0.05%、初始糖度25%,發(fā)酵溫度分別為15、20、25、30、35 ℃進行接種發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束測定黃酮和總酚含量并記錄發(fā)酵時間。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,以影響仙人掌發(fā)酵酒的料水比(A)、酵母接種量(B)、初始糖度(C)、發(fā)酵溫度(D)為考察因素,以規(guī)范化綜合得分為響應值,根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理設計響應面試驗,實驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factor and level table for response surface experiment

1.2.4 酒精度測定 采用密度瓶法[11],將酒樣恒溫至20 ℃,用潔凈干燥的容量瓶準確量取100 mL于500 mL蒸餾瓶中,用50 mL蒸餾水分三次洗滌容量瓶,洗液并入容量瓶,加入三粒玻璃珠,通過蒸餾裝置緩慢加熱蒸餾,收集流出液接近刻度線,恒溫20 ℃,補加蒸餾水至刻度線,用干燥密度瓶進行稱量,根據(jù)流出液密度公式進行計算密度,對照酒精水溶液密度與酒精度對照表確定乙醇含量(20%)。

1.2.5 黃酮含量的測定 分光光度法[12],取5 mL酒樣于20 mL容量瓶,加入3.25 mL無水乙醇超聲(10 W,50 Hz)處理30 min制得待測液,吸取待測液 1 mL于25 mL容量瓶,分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,靜置6 min,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,再加蒸餾水至刻度線,在波長510 nm處測定吸光值。用蘆丁為當量制作標準曲線,根據(jù)標準曲線算出樣品的總黃酮當量(μg/mL)。

1.2.6 總酚含量的測定 福林酚法[13],取1 mL 酒樣于15 mL試管,分別加入1 mL福林酚顯色劑,3 mL 20%碳酸鈉溶液,混勻,50 ℃水浴30 min,冷卻至室溫,760 nm處測定其吸光值,以沒食子酸為當量制作標準曲線,根據(jù)標準曲線算出樣品的總酚當量(μg/mL)。

1.2.7 總酸的測定(以檸檬酸計) 滴定法[14],取2 mL酒樣置于50 mL錐形瓶中,加蒸餾水值刻度線,再加入兩滴酚酞指示劑,立即用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定,30 s不褪色,記錄氫氧化鈉的體積進行計算。

1.2.8 總糖的測定 3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[15],取酒樣1 mL置于15 mL具塞試管中,加入1∶1鹽酸7 mL,80 ℃水浴30 min,加2 mL DNS試劑,沸水煮沸2 min,冷卻,再加蒸餾水至刻度線,在540 nm處測定吸光度值,以葡萄糖為當量制作標準曲線,根據(jù)標準曲線算出樣品的總糖當量(mg/mL)。

1.2.9 微生物指標 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 酒類檢驗:GB 2758-2012[16]。

1.2.10 感官評價方法 根據(jù)國標方法[11],由20名食品專業(yè)研究生組成感官分析小組。參照宋琳琳等[17]的方法并進行相應調(diào)整,滿分100,結(jié)果取平均值,評價標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Standard of sensory evaluation

1.3 主成分提取與數(shù)據(jù)處理

對仙人掌發(fā)酵酒的各指標進行了主成分分析,得到原始數(shù)據(jù)的貢獻率、累計貢獻率及特征值,將大于1的特征值因子作為主成分提取標準[18]。根據(jù)特征向量值(各自主成分載荷向量除以各自主成分特征值的算術(shù)平方根,即為特征向量值)確定各自主成分對應的指標。按式(1)計算仙人掌發(fā)酵酒各個實驗組的綜合得分F,再按公式(2)將得到的綜合得分F進行規(guī)范化處理得到規(guī)范化綜合得分Z[19]。

式(1)

式(2)

式中:F為綜合得分,Y1、Y2、Y3為主成分的特征值,F1、F2、F3為仙人掌發(fā)酵酒的主成分1、2、3的得分,C為累積特征值,Z為規(guī)范化綜合得分,Fmax為綜合得分中最大值,Fmin為綜合得分中最小值。

響應面試驗設計以及結(jié)果分析用Design-Expert 10.0軟件進行處理,主成分進行因子分析采用SPSS 20.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料水比對發(fā)酵的影響 由圖1可知,加水比例增大,黃酮、總酚等有效成分含量在酒中的比例都會降低,但加水少時,由于仙人掌中粘多糖含量高,制得的仙人掌汁粘稠,發(fā)酵會受到影響,同樣會影響黃酮、總酚的溶出。因此,實驗最終選擇料水比1∶4比較好,既不影響發(fā)酵又可使黃酮、總酚盡可能地達到較多的含量。

圖1 料水比對仙人掌發(fā)酵酒發(fā)酵的影響

2.1.2 酵母接種量對發(fā)酵的影響 由圖2 可知,隨著酵母接種量增大使酵母的生長速率、發(fā)酵速率、發(fā)酵周期和呼吸率都發(fā)生了變化,發(fā)酵速率變快,代謝加強,酵母之間的競爭激烈,溫度不斷升高,甚至代謝系統(tǒng)紊亂,發(fā)酵體系的變化使黃酮、總酚的穩(wěn)定性發(fā)生變化,造成其含量下降。同時由于接種量的變化,使得代謝速率的快慢發(fā)生變化,對代謝產(chǎn)物種類和含量也有了一定的影響,對酒體的風味口感造成影響,通過感官品評以及對黃酮與總酚含量的衡量,實驗確定了最佳接種量為0.05%。在此接種量下酒體澄清,酒香、純正濃郁,酒中黃酮和總酚含量相對較高,接種量太小發(fā)酵速度緩慢,發(fā)酵周期太長,黃酮和總酚含量受到影響。

圖2 酵母接種量對仙人掌發(fā)酵酒發(fā)酵的影響

2.1.3 初始糖度對發(fā)酵的影響 由圖3可知,在一定條件下,初始糖度的確定決定著合適的酒精度。糖度過大過小都會對酒的品質(zhì)有影響。糖度過大發(fā)酵液的滲透壓增加,酵母菌受到抑制,使發(fā)酵不徹底,甚至產(chǎn)生副反應[20],其口感也下降。糖度太低，酒度過低,酒的口感寡淡,也會影響對黃酮、總酚的溶出。通過實驗表明,當初始糖度為25%時,發(fā)酵酒度適中,黃酮、總酚含量相對較好,酒體協(xié)調(diào),酒味濃郁,仙人掌的風味比較典型,因此,確定25%為發(fā)酵最佳初始糖度。

圖3 初始糖度對仙人掌發(fā)酵酒發(fā)酵的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度極大地影響著酵母的代謝產(chǎn)物以及發(fā)酵速率[21]。溫度高,酵母生長快,發(fā)酵時間短,但產(chǎn)物積累過快,風味欠佳。溫度低,酵母生長緩慢,代謝產(chǎn)物的合成積累時間充分,酒的風味較好。同時,不同溫度所造成的發(fā)酵體系環(huán)境有所不同,對黃酮與總酚含量有影響,溫度升高,分子滲透、擴散、溶解速度加快,使活性物質(zhì)易于從果肉細胞轉(zhuǎn)移到發(fā)酵液中[22]。由圖4可知,實驗通過感官品評以及參考黃酮、總酚含量,得出當發(fā)酵溫度為15、20 ℃時,感官評分高,黃酮、總酚含量適中,但考慮到發(fā)酵周期,最后選擇20 ℃進行發(fā)酵。

圖4 發(fā)酵溫度對仙人掌發(fā)酵酒發(fā)酵的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)表1進行Box-Benhnken中心組合實驗設計,共29個實驗點,研究各因素對仙人掌發(fā)酵酒酒精度、總糖、黃酮、總酚、總酸和感官評價的影響。響應面試驗設計及結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Box-Benhnken experimental design and results

2.2.1 仙人掌發(fā)酵酒的主成分分析 采用SPSS 20.0對表3中仙人掌發(fā)酵酒指標酒精度、總糖、黃酮、總酚、總酸和感官評價進行主成分分析[23],主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻率見表4,根據(jù)大于80%的累積貢獻率,提取的三個主成分累積貢獻率為80.361%,可以說明提取的三個主成分能夠全面地反映仙人掌發(fā)酵酒的品質(zhì)信息[24]。通過仙人掌發(fā)酵酒的指標特征向量絕對值,表5得到,決定第一主成分的指標主要是總酸、酒精度和總糖,第二主成分的指標主要是黃酮和總酚,第三主成分的指標主要是總酸和感官評價。

表4 仙人掌發(fā)酵酒中主成分的貢獻率及特征值Table 4 Contribution rates and characteristic values and of principal components in cactus wine

由于各個指標間存在單位和變異程度的差異,因此對綜合得分F進行規(guī)范化處理后得到規(guī)范化綜合得分Z,再以Z作為響應值進行響應面分析,其結(jié)果如表6所示。

表6 主成分得分與規(guī)范化綜合得分Table 6 Principal component scores and standardized score

2.2.2 規(guī)范化綜合得分的響應面分析 利用Design-Expert 10.0軟件對29個實驗點和對應的規(guī)范化綜合得分進行多元歸擬合,得到回歸模型方差分析見表7,各因素間的相互作用見圖5,得到的回歸模型方程如下:

表7 回歸模型方差分析Table 7 Analysis variance of regression model

Z=0.83-0.12A-0.012B+0.084C+0.11D+0.065AB-0.085AC+0.011AD+0.0063BC+0.094BD+0.31CD-0.35A2-0.17B2-0.23C2-0.19D2

由表7回歸模型方差分析可知,p<0.0001,該模型項顯著性極高,并且該模型失擬項p>0.05,差異性不顯著,表明模型建模成功。決定系數(shù)R2=0.9599大于0.9,說明該模型實際值與預測值擬合性較高,所以用此模型對實驗數(shù)據(jù)進行分析和預測[25]。各因素中,一次項A、C、D為極顯著,B不顯著,交互項CD為極顯著(p<0.01),AC、BD顯著(p<0.05),AB、AD、BC不顯著(p<0.01),二次項A2、B2、C2、D2均為極顯著(p<0.05)。按照比較F值大小可知影響仙人掌發(fā)酵品質(zhì)的因素順序為:料水比(A)>發(fā)酵溫度(D)>初始糖度(C)>酵母接種量(B)。

2.2.3 各因素交互分析 響應面能夠直接反映各因素與響應值規(guī)范化綜合得分之間的關(guān)系和各因素間的交互作用,響應面的陡峭程度反映了兩個因素的交互作用影響的大小,響應面的坡度越陡,等高線密集形成橢圓則反映兩因素的交互作用的影響越大,反之,兩因素的交互作用影響不大。由圖5可以看出,發(fā)酵溫度與初始糖度的響應面坡度最陡峭,其等高線形成半橢圓,表明CD的交互作用極顯著(p<0.01),表明對響應值規(guī)范化綜合得分影響較大。料水比與初始糖度、酵母接種量與發(fā)酵溫度的響應面較為陡峭,其等高線密集并形成橢圓,交互作用顯著(p<0.05),表明對響應值規(guī)范化綜合得分影響大。

圖5 各因素間的交互作用

2.2.4 驗證實驗 根據(jù)響應面分析軟件得出的最佳工藝條件參數(shù)為:料水比1∶4,酵母接種量0.05%,初始糖度24.65%,發(fā)酵溫度18.89 ℃,在此條件下,規(guī)范化綜合得分為0.916。通過對預測工藝優(yōu)化確定條件進行調(diào)整初始糖度為25%、發(fā)酵溫度為20 ℃釀造仙人掌發(fā)酵酒,最終得到仙人掌發(fā)酵酒酒精度為12.9%,黃酮含量為6.2 μg/mL,總糖為5.2 mg/mL,總酚為38.6 μg/mL,總酸為4.9 g/L,規(guī)范化綜合得分為0.899,與預測的數(shù)值基本一致,因此該模型基本準確,表明響應面分析與主成分分析法相結(jié)合得到的仙人掌酒發(fā)酵工藝參數(shù)對仙人掌酒的生產(chǎn)具有指導意義。

2.3 仙人掌發(fā)酵酒質(zhì)量指標

2.3.1 感官指標 外觀色澤呈淡黃色、澄清透明,酒體協(xié)調(diào)、醇厚、柔和,風格獨特,有典型的仙人掌風味。

2.3.2 理化指標 酒度12.9%、總糖5.2 mg/mL、黃酮含量為6.2 μg/mL、總酚為38.6 μg/mL、總酸為4.9 g/L。

2.3.3 微生物指標 符合GB 2758-2012所規(guī)定的要求。

3 結(jié)論

以仙人掌片為原料,進行發(fā)酵仙人掌酒,通過優(yōu)化實驗得出最佳發(fā)酵工藝條件為:料水比1∶4,酵母接種量0.05%,初始糖度25%,發(fā)酵溫度20 ℃。在此條件下發(fā)酵的仙人掌酒酒精度為12.9%,黃酮含量為6.2 μg/mL,總酚為38.6 μg/mL。通過實驗發(fā)現(xiàn),仙人掌酒的發(fā)酵適合于相對較低一些的溫度發(fā)酵,能夠保持仙人掌的清香,還可以發(fā)揮酵母的代謝香氣,獲得的仙人掌酒酒體柔和、清香淡雅,具有典型的仙人掌特有的風味。仙人掌本身具有很好的營養(yǎng)價值和開發(fā)價值,本研究開發(fā)成仙人掌酒,既保留了仙人掌本身的功效,又增加了酵母菌的代謝產(chǎn)物,特別是在酒精的作用下使仙人掌的有效成分更加容易吸收。由于仙人掌的功效突出在國外主要作為蔬菜鮮食食用,但是國內(nèi)還不是非常適應作為鮮食蔬菜食用,因此,開發(fā)仙人掌酒為今后大力推廣仙人掌深加工提供了新的思路,對仙人掌酒的開發(fā)具有一定的指導意義。