錦橙中β-葡萄糖苷酶的提取純化及其結(jié)構(gòu)表征

任婧楠,范 剛,張璐璐,潘思軼,王可興

(環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又稱為β-D-葡萄糖苷水解酶,它包含一個異構(gòu)組的酶,能水解雙糖或低聚糖的β-葡萄糖苷鍵及其他的葡萄糖共軛鍵使其斷開,從而釋放出糖苷及其配基[1]。β-葡萄糖苷酶廣泛分布于自然界生物中,如植物、昆蟲、酵母、霉菌和細(xì)菌[2-3],并在許多生命過程中都扮演著關(guān)鍵角色。例如香氣的釋放[4-5],異黃酮苷的水解[6],花色苷配體的釋放[7],纖維素生物質(zhì)的降解[8],生氰作用[9]等過程,β-葡萄糖苷酶還被認(rèn)為在細(xì)胞壁降解的過程中起到一定的作用[10]。一些植物來源的β-葡萄糖苷酶具有高度的底物專一性[11]。β-葡萄糖苷酶的相對分子質(zhì)量一般在40～250 kDa之間,不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子質(zhì)量有很大差異,這是由于它們在不同的生物體中的結(jié)構(gòu)和組成不同[12]。不同來源的β-葡萄糖苷酶的活性也存在差異,Dong等[13]從Paenibacillus菌株分離的β-葡萄糖苷酶的活性達(dá)15.40 U/mg。

目前國內(nèi)外的研究學(xué)者已經(jīng)對各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了大量的研究[14],然而,柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。據(jù)報(bào)道,β-葡萄糖苷酶分布于柑橘果實(shí)的各個部位,在柑橘果實(shí)鍵合態(tài)香氣水解釋放、檸檬苦素類物質(zhì)糖苷水解及花色苷降解過程中起到重要作用[14]。Ren等[15]研究了柑橘生長過程中β-葡萄糖苷酶的酶活變化,并發(fā)現(xiàn)柑橘在成熟過程中β-葡萄糖苷酶酶活呈上升趨勢。柑橘不同組織部位中β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的。Burns和Baldwin[16]研究發(fā)現(xiàn)葡萄柚白皮層中β-葡萄糖苷酶活性最高,其次為果皮,而果汁中的活性最低。Barbagallo等[17]研究發(fā)現(xiàn)血橙果肉中β-葡萄糖苷酶的酶活高于離心果汁中的酶活,由此得出結(jié)論,柑橘中的β-葡萄糖苷酶主要與固態(tài)部分結(jié)合緊密,有可能與果膠鏈結(jié)合在一起。

目前,國內(nèi)外的研究學(xué)者已經(jīng)對各種來源的β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了大量的研究,如玉米秸稈[18]、橄欖[19]、橡膠樹[20]、杏[21]。然而,對于柑橘中β-葡萄糖苷酶的研究還比較少。本文以錦橙為原料,對其果皮與果肉中的β-葡萄糖苷酶分別進(jìn)行提取純化,并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,為β-葡萄糖苷酶在影響柑橘品質(zhì)方面的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錦橙 采自重慶市,選取樹勢健壯、生長結(jié)果正常的果樹摘取果實(shí),果實(shí)可固含量為11 °Brix,總酸0.78%;檸檬酸、磷酸氫二鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、硫酸銨、氫氧化鈉、碳酸鈉、對硝基苯酚-β-葡萄糖醛酸苷(p-NPG)、碳酸氫鈉、鹽酸、Tris、乙酸、聚乙二醇 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DEAE-瓊脂糖凝膠 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

Eppendorf高速冷凍離心機(jī) 北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司;BSZ-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;DU700紫外-可見光分光光度計(jì) 美國貝克曼庫爾特有限公司;Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀 美國伯樂公司;MK-3多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司;XGT-1000WRX熒光光譜儀 日本Horiba公司;Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 錦橙果皮和果肉中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制備 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在橙皮或果肉中加入一定量(橙皮∶緩沖液=1∶2)的檸檬酸-磷酸緩沖液(pH6.0)和10%的PVPP,移入榨汁機(jī)中榨汁5 min,將所得勻漿于4 ℃下浸提過夜,然后在6000 g的條件下冷凍離心15 min,結(jié)束后取上清液。

1.2.2β-葡萄糖苷酶的硫酸銨沉淀 參照宋娜娜等[22]的方法,并作適當(dāng)修改。向1.2.1中的粗酶液中緩慢加入25%飽和度的硫酸銨溶液,于4 ℃靜置過夜,4 ℃、6000 g離心15 min,收集上清液。然后向上清液中加入90%飽和度的硫酸銨溶液,于4 ℃靜置過夜,4 ℃、6000 g離心15 min,收集沉淀,將沉淀溶于適量pH6.0、檸檬酸-磷酸緩沖液中。

1.2.3 透析法除鹽、濃縮 將透析袋剪為20 cm左右,置于2%(W/V)碳酸氫鈉和1.0 mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10 min,蒸餾水清洗之后,再于1.0 mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸,冷卻之后存于4 ℃。將1.2.2中的緩沖液移至透析袋中,蒸餾水作為透析液,每4～6 h更換一次透析液,透析過夜,收集透析袋中的溶液。將透析所得溶液仍裝入透析袋中,用聚乙二醇覆蓋透析袋脫水至體積≤25 mL[23]。

1.2.4 DEAE-Sepharose柱層析 濃縮酶液上樣于已用Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液平衡的DEAE-sepharose層析柱中(φ 1.6 cm×30 cm)。先后用1000 mL 0.35 mol/L NaCl溶液(溶于平衡緩沖液)和1000 mL 0.4 mol/L NaCl溶液(溶于平衡緩沖液)進(jìn)行洗脫,流速3.0 mL/min,分別收集0.35 mol/L NaCl洗脫液和0.4 mol/L NaCl洗脫液,每管3 mL。以管號為橫坐標(biāo),酶活為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。

1.2.5β-葡萄糖苷酶活性測定 采用1.0 mol/L的Na2CO3溶液作為溶劑,分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 μmol/mL的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。以蒸餾水為對照,在紫外可見區(qū)域掃描各個濃度的最大吸收峰。以對硝基苯酚的濃度為橫坐標(biāo),以在最大吸收波長405 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)繪制對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參照孫艷梅等和羅小娟等[24-25]的方法,并稍作修改。將3 mL 10 mmol/L的p-NPG加入到20 mL的酶液中,在適宜溫度下進(jìn)行反應(yīng),在1 min后通過加入1.0 mL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液來終止反應(yīng),然后在400 nm波長處測定吸光度。利用對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可以計(jì)算出所生成的對硝基苯酚的濃度。β-葡萄糖苷酶的酶活單位為U/g,定義1 U為在一定條件下,以p-NPG為底物,每分鐘釋放出1.0 μmol對硝基苯酚所需要的酶量。

1.2.6 酶液中蛋白質(zhì)濃度的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液作為空白,牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以Tris-HCl(0.05 mol/L,pH8.2)緩沖液做溶液,分別配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。移取空白溶液以及標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液各50 μL,分別加入200 μL考馬斯亮藍(lán)溶液,立即放入酶標(biāo)儀中于595 nm下測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度作為橫坐標(biāo),相應(yīng)吸光度作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將所得各份酶液各取50 μL,分別加入200 μL考馬斯亮藍(lán)溶液,立即放入酶標(biāo)儀中于595 nm下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出各濃縮酶液中蛋白質(zhì)濃度。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量 參照劉穎等[26]的方法,并做適當(dāng)修改。先加入15%的分離膠,使其略高于凝膠板上所劃分離線,再加入少量蒸餾水。靜置1 h后,倒掉蒸餾水,加入5%濃縮膠,立即插入梳子。靜置20 min后,平衡地移除梳子,加入電泳液直至加滿。此時將配制好的樣品用微量進(jìn)樣器加入槽中(20～25 μL),并用微量進(jìn)樣器取10 μL蛋白質(zhì)Marker加入另一槽中。將電泳槽放入外殼中,并向其中加入約體積一半的電泳液。封蓋,通電,調(diào)節(jié)A=15 mA,U=80 V,電泳開始。待樣品移動到分離膠時,調(diào)節(jié)A=30 mA,U=100 V。待樣品移動到距凝膠板約1.0 cm時,可停止電泳。根據(jù)樣品條帶以及蛋白質(zhì)Marker 條帶,即可得出所測酶的分子量。

1.2.8 熒光光譜分析 配制蛋白質(zhì)濃度為0.4 mg/mL的酶液,采用熒光光譜儀進(jìn)行熒光測定,測定時先在350 nm發(fā)射波長下掃描得到其最大激發(fā)波長,然后用最大激發(fā)波長對蛋白質(zhì)進(jìn)行掃描得到各發(fā)射光譜。激發(fā)光譜的操作條件為:掃描范圍200～500 nm,掃描速度200 nm/min,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為10 nm,響應(yīng)時間0.1 s,記錄數(shù)據(jù)波長間隔為1 nm。

1.2.9 粒徑測定 采用納米粒度及Zata電位分析儀進(jìn)行粒徑的測定,散射光為波長532 nm的激光,激光反射角為15°,測定蛋白質(zhì)濃度為0.4 mg/mL的酶液的粒徑,每組測量重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

三次平行實(shí)驗(yàn)測定得到的各實(shí)驗(yàn)平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行計(jì)算,并使用SPSS Statistics 24進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液洗脫效果的比較

根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:Y=16.966X+0.0165(Y為對硝基苯酚在最大吸收波長處的吸光度,X為對硝基苯酚的濃度(μmol/mL))。相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程測定各管洗脫液中β-葡萄糖苷酶的活性。

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果皮中β-葡萄糖苷酶的酶活如圖1所示,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的第13管酶液的酶活最高,達(dá)15.3×10-3U/g,收集得到的所有15管酶液的平均酶活為(6.57±4.27)×10-3U/g。0.4 mol/L NaCl洗脫得到的第9管酶液的酶活最高,最高達(dá)5.33×10-3U/g,收集得到的所有12管酶液的平均酶活為(3.49±0.92)×10-3U/g。顯著性分析結(jié)果顯示,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中β-葡萄糖苷酶的平均酶活顯著高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性(p<0.05)。

圖1 果皮中不同濃度NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果肉酶活如圖2所示,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的第7管酶液的酶活最高,達(dá)7.28×10-3U/g,收集得到的所有17管酶液的平均酶活為(4.66±1.35)×10-3U/g。而0.4 mol/L NaCl洗脫得到的第9管酶液的酶活最高,僅為4.69×10-3U/g,收集得到的所有17管酶液的平均酶活為(3.81±0.56)×10-3U/g。果肉中0.35 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶的平均酶活高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶的平均酶活,但是沒有顯著性差異(p>0.05)。

圖2 果肉中不同濃度NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性

此外,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中β-葡萄糖苷酶的平均酶活顯著高于同一濃度NaCl溶液洗脫得到的果肉中的酶活(p<0.05)。而果皮中0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶酶活與同一濃度NaCl溶液洗脫得到的果肉中的酶活沒有顯著性差異(p>0.05)。這說明過高濃度NaCl洗脫對所得的β-葡萄糖苷酶的酶活會造成抑制作用,且0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果皮中的酶活顯著高于果肉中的酶活。相同的結(jié)果也在Burns和Baldwin[16]的研究中得到,他們發(fā)現(xiàn)葡萄柚果皮中β-葡糖糖苷酶的活性高于果肉。Barbagallo等[17]發(fā)現(xiàn)血橙果肉中β-葡糖糖苷酶的酶活(1.5×10-3U/g)高于果汁中的酶活,其原因可能是由于柑橘中的β-葡糖糖苷酶主要與固態(tài)部分緊密結(jié)合,有可能是與果膠結(jié)合在一起。然而其酶活低于本文中檢出的錦橙果肉和果皮中的酶活,其原因與所用柑橘原料的品種、提取純化條件等都有關(guān)。

2.2 純化酶液中蛋白質(zhì)濃度

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:Y=6.2957X+0.3644(Y為牛血清白蛋白在最大吸收波長處的吸光度,X為牛血清白蛋白的濃度),相關(guān)系數(shù)R2=0.9918。由表1可知,不同濃度NaCl溶液洗脫得到的果皮和果肉酶液的蛋白質(zhì)濃度存在一定差異,0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果皮酶液中蛋白質(zhì)濃度是0.4 mol/L NaCl洗脫液中蛋白質(zhì)濃度的2.4倍,且采用0.35 mol/L NaCl洗脫得到的果肉酶液蛋白質(zhì)濃度也比0.4 mol/L NaCl洗脫液中蛋白質(zhì)濃度高。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.35 mol/L NaCl洗脫酶液。

表1 不同濃度NaCl洗脫果皮和果肉酶液中的蛋白質(zhì)濃度Table 1 The protein contents in different concentrations of NaCl eluent from pulp and peel

2.3 測定純化的β-葡萄糖苷酶的分子量

β-葡萄糖苷酶粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose柱層析之后得到純化的β-葡萄糖苷酶,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳只顯示一條帶(圖3),其分子量略高于170 kDa,粗略估計(jì)為170～250 kDa之間。不同來源的β-葡萄糖苷酶的分子量也不一樣,Zhang等[27]測出經(jīng)重組的大腸桿菌中的β-葡萄糖苷酶的分子量為52 kDa,Sathe等[28]分離純化了Methylococcus capsulatus中的β-葡萄糖苷酶,并測得其分子量為50.7 kDa,Kar等[3,21]從Putranjiva roxburghii中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的分子量約為66 kDa。

圖3 純化的果皮β-葡萄糖苷酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.4 熒光光譜分析

β-葡萄糖苷酶酶液先在350 nm發(fā)射波長下掃描得到其最大激發(fā)波長290 nm,再在290 nm激發(fā)波長下掃描得到熒光光譜。如圖4所示,根據(jù)熒光光譜結(jié)果可知,β-葡萄糖苷酶的最大熒光吸收峰在582 nm左右。熒光光譜分析法是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效方法,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、試樣量少和方法簡便等優(yōu)點(diǎn)[29]。劉宇等[30]發(fā)現(xiàn)橡膠籽中β-葡萄糖苷酶的熒光峰為335 nm左右,低于本文中的結(jié)果。最大熒光吸收峰的不同與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸存在密切的關(guān)系[29]。

圖4 β-葡萄糖苷酶的熒光光譜分析

2.5 粒徑分布測定

β-葡萄糖苷酶酶液的粒度分布如圖5所示,可以看出,該酶的粒徑范圍約為5～25 nm。該酶體系的粒徑分布曲線呈正態(tài)分布形態(tài),是一種比較穩(wěn)定的體系狀態(tài)。有關(guān)β-葡萄糖苷酶粒徑分布的研究很少。體系中蛋白質(zhì)的粒徑分布受到很多因素的影響,進(jìn)而影響其功能作用。齊寶坤等[31]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的表面疏水性與粒徑大小之間存在極顯著的線性負(fù)相關(guān)。蛋白質(zhì)的粒徑分布較大,說明蛋白分子之間相互聚集形成較多聚集體,這會使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)內(nèi)卷,減少蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)的暴露[32],從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的降低[31]。有關(guān)體系中β-葡萄糖苷酶的粒度分布對其性質(zhì),尤其是酶活的影響還需進(jìn)一步研究。

圖5 β-葡萄糖苷酶酶液的的粒徑分布

3 結(jié)論

不同濃度NaCl洗脫液洗脫得到的果皮中β-葡萄糖苷酶的酶活存在顯著差異,果皮中0.35 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于0.4 mol/L NaCl洗脫液中的β-葡萄糖苷酶活性和果肉中的0.35 mol/L和0.4 mol/L NaCl洗脫液中的酶活(p<0.05),且0.35 mol/L NaCl洗脫液中的蛋白質(zhì)濃度最高,達(dá)0.154 mg/mL。在該條件下提取得到的β-葡萄糖苷酶的分子量略高于170 kDa。β-葡萄糖苷酶的最大熒光吸收峰為582 nm,該酶的粒徑范圍為5～25 nm。