熱變性牛血清白蛋白對三種活性物質(zhì)的復(fù)合和保護(hù)作用

董煥煥,烏斯嘎勒,馮穩(wěn)穩(wěn),梁 麗,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

隨著人們對多種營養(yǎng)素需求的不斷增大,將不同營養(yǎng)活性物質(zhì)強(qiáng)化于一種產(chǎn)品中,生產(chǎn)具有多種有益健康的功能食品,已引起廣大研究者的研究興趣[1]?；钚晕镔|(zhì)的共存也可能出現(xiàn)“1+1>2”的生物活性或者提高穩(wěn)定性。例如:蕓香柚皮苷和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)復(fù)配后具有增效的抗氧化活性[2];γ-生育酚、白藜蘆醇和EGCG的復(fù)配對乳腺癌細(xì)胞的抑制具有增效作用[3];白藜蘆醇提高了包埋在玉米醇溶蛋白中α-生育酚的穩(wěn)定性[4]。生物活性物質(zhì)易受到外界環(huán)境的影響而發(fā)生氧化、降解、聚合等現(xiàn)象,設(shè)計和開發(fā)能夠同時包埋多種活性物質(zhì)并提高其穩(wěn)定性的可食用載體成為必然。

牛血清白蛋白(BSA)是研究最廣泛的配體結(jié)合蛋白之一,可以和不同化合物結(jié)合形成復(fù)合物,包括疏水性的維生素E、脂肪酸等[5];親水性的EGCG、胭脂紅等[6-7];兩親性的白藜蘆醇[8]。由于不同活性物質(zhì)在BSA的結(jié)合位點(diǎn)不同,BSA可能與不同活性物質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)-多配體復(fù)合物[9]。BSA含有三個相似的結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每個結(jié)構(gòu)域由兩個螺旋結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)(A、B)組成,其中子域ⅡA和ⅢA是活性物質(zhì)的主要結(jié)合位點(diǎn)[10]。但是,由于小分子(配體)與蛋白之間的非專一性/競爭性結(jié)合,多種配體與蛋白形成復(fù)合物的過程中,小分子的添加順序?qū)?fù)合物的形成至關(guān)重要,如黃酮類化合物的存在減小了艾普拉唑與BSA間猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)[11];白藜蘆醇/EGCG降低了視黃醇誘導(dǎo)的BSA熒光淬滅率[9]。

牛血清白蛋白是熱敏感性蛋白[12],在進(jìn)行高于其變性溫度處理時,蛋白質(zhì)會發(fā)生去折疊,丟失部分二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)熱變性在破壞天然構(gòu)象結(jié)合位點(diǎn)的同時會暴露內(nèi)部的疏水基團(tuán),更有利于蛋白質(zhì)和配體間相互作用。此外,熱誘導(dǎo)蛋白可能形成新的結(jié)合位點(diǎn),從而加強(qiáng)蛋白與活性物質(zhì)間結(jié)合,如熱變性處理使β-乳球蛋白和茶多酚間親和力增強(qiáng)了3.5倍[13],熱處理后的BSA對EGCG表現(xiàn)出了更好的保護(hù)效果[14]。而目前對于BSA熱變性后與不同溶解性活性物質(zhì)之間的相互作用研究較少。本文探究了熱變性BSA與不同溶解性活性物質(zhì)α-生育酚、白藜蘆醇和EGCG之間的相互作用,并對熱變性BSA作為不同溶解性活性物質(zhì)載體對活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的保護(hù)進(jìn)行評價,研究結(jié)果將為基于蛋白質(zhì)的共包埋載體的開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白(純度≥98%)、α-生育酚(1000 IU/g)、白藜蘆醇(反式,純度≥99%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(藥品二級標(biāo)準(zhǔn)) Sigma-Aldrich公司;2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(純度≥97%) 生工生物工程(上海)股份有限公司;無水乙醇(GR)、鹽酸(GR)、氫氧化鈉(AR)、磷酸氫二鉀(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、過硫酸鉀(AR)、疊氮化鈉 國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜醇) 百靈威科技有限公司;實(shí)驗(yàn)中所有用水均為Milli-Q超純水。

EL3002電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;e2695高效液相色譜儀(2998二級管陣列檢測器) 美國沃特世公司;Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司;FB9232D-PC恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技儀器有限公司;SpectraMax M5酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白與活性物質(zhì)之間的結(jié)合

1.2.1.1 熱變性BSA(hBSA)溶液的配制 將α-生育酚、白藜蘆醇和EGCG分別溶解在無水乙醇、70%乙醇和10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶液(配制方法參考文獻(xiàn)[9])中,配制2 mmol/L的母液,并利用pH7.4 10 mmol/L緩沖液稀釋至200 μmol/L待用。將BSA溶解在磷酸鹽緩沖液中,測量蛋白溶液在280 nm處的吸光度,根據(jù)摩爾吸光系數(shù)(43800 M-1cm-1)[15],計算得到蛋白的具體濃度,并通過適當(dāng)稀釋將濃度定為100 μmol/L,得到天然BSA,然后在85 ℃下加熱30 min獲得hBSA[12]。

1.2.1.2 蛋白-單配體復(fù)合物的制備 蛋白-α-生育酚復(fù)合物的制備參考文獻(xiàn)[9]并適當(dāng)修改:在5 mL離心管中依次加入3.88、3.82、3.72、3.62、3.52 mL磷酸鹽緩沖液,然后均加入0.08 mL上述制備得到的100 μmol/L蛋白,再依次加入200 μmol/Lα-生育酚0.04、0.1、0.2、0.3、0.4 mL形成4 mL的反應(yīng)體系,避光靜置反應(yīng)30 min以保證蛋白與配體之間充分結(jié)合。體系中蛋白終濃度為2 μmol/L,α-生育酚終濃度依次為2、5、10、15、20 μmol/L。相同的方法制備蛋白-白藜蘆醇復(fù)合物和蛋白-EGCG復(fù)合物。

1.2.1.3 單一配體與蛋白之間的結(jié)合 使用Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計,以280 nm作為激發(fā)波長,發(fā)射波長范圍為290～550 nm,激發(fā)、發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm。固定hBSA濃度2 μmol/L,依次增大活性物質(zhì)濃度,扣除相應(yīng)樣品中活性物質(zhì)的背景熒光后,計算活性物質(zhì)對蛋白熒光的淬滅率[9],計算公式如下:

式中,F0為不加入活性物質(zhì)時,蛋白在最大熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度值;F1為加入活性物質(zhì)時,蛋白在最大熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度值。

1.2.2 活性物質(zhì)與hBSA結(jié)合的競爭實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 蛋白-多配體復(fù)合物的制備 蛋白-多配體復(fù)合物包括蛋白-二配體復(fù)合物和蛋白-三配體復(fù)合物,制備方法參考文獻(xiàn)并略做修改[9]。其中蛋白-二配體復(fù)合物的配制為:在緩沖液中加入適量的hBSA,加入第一個活性物質(zhì)(配體1),避光靜置反應(yīng)30 min保證蛋白與配體1之間充分結(jié)合,其次加入第二個加入的活性物質(zhì)(配體2),避光靜置反應(yīng)30 min保證蛋白與配體2之間充分結(jié)合形成蛋白質(zhì)-二配體復(fù)合物,其中EGCG、白藜蘆醇、α-生育酚作為配體1時的濃度分別為5、5、10 μmol/L,作為配體2時的濃度范圍均為2、5、10、15、20 μmol/L。

蛋白-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物的配制:在緩沖液中加入適量的5 μmol/LEGCG,避光靜置反應(yīng)30 min,其次加入10 μmol/Lα-生育酚,避光靜置反應(yīng)30 min,最后加入5 μmol/L白藜蘆醇,靜置反應(yīng)30 min。

1.2.2.2 多配體與蛋白之間的結(jié)合 在競爭實(shí)驗(yàn)中參考文獻(xiàn)并做適當(dāng)修改[9],探究配體1的存在對配體2與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響,配體1和配體2的熒光均要扣除,配體2對蛋白熒光淬滅率的計算公式如下:

式中,F1為配體1加入時,蛋白在最大熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度值;F2為配體1和配體2一起加入時,蛋白在最大熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度值。

1.2.3 hBSA對活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù) 利用高效液相色譜測定儲藏過程中三種活性物質(zhì)的穩(wěn)定性,比較游離態(tài)活性物質(zhì)的穩(wěn)定性以及hBSA-單配體復(fù)合物(hBSA-EGCG、hBSA-白藜蘆醇、hBSA-α-生育酚)、hBSA-二配體復(fù)合物(hBSA-EGCG-α-生育酚、hBSA-EGCG-白藜蘆醇、hBSA-α-生育酚-白藜蘆醇))和hBSA-三配體復(fù)合物(hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇)中蛋白對配體結(jié)構(gòu)的保護(hù)情況,其中蛋白和活性物質(zhì)的濃度均為10 μmol/L。色譜條件:C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm,Waters),二元流動相分別為A:100%甲醇,B:水/乙酸(99.8∶0.2,v/v),流動相梯度參考文獻(xiàn)[9],梯度為0 min,18% A;0.5 min,18% A;1.5 min,25% A;3.5 min,25% A;4.5 min,43% A;5.5 min,43% A;6.5 min,50% A;7.5 min,60% A;8.5 min,50% A;14 min,50% A;15 min,60% A;16 min,90% A;17 min,100% A;30 min,100% A;31 min,18% A;33 min,18% A。流速為1 mL/min,色譜柱溫度為35 ℃,進(jìn)樣量為40 μL,能夠?qū)GCG、白藜蘆醇、α-生育酚依次分離出來,檢測波長分別為279、306、292 nm。

樣品溶液置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲藏,分別在0、10、24、48、72、144、288 h取一定量樣品溶液,測定活性物質(zhì)的殘留率,殘留率按照以下公式計算:

式中:At為活性物質(zhì)在取樣時間的峰面積值;A0為生物活性物質(zhì)在初始時的峰面積值。

1.2.4 hBSA對活性物質(zhì)抗氧化活性的保護(hù) 利用ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)評價蛋白對活性物質(zhì)抗氧化活性的保護(hù),比較游離態(tài)活性物質(zhì)的抗氧化穩(wěn)定性以及hBSA-單配體復(fù)合物、hBSA-二配體復(fù)合物和hBSA-三配體復(fù)合物中蛋白對活性物質(zhì)抗氧化活性的保護(hù)情況,其中蛋白和活性物質(zhì)的濃度均為10 μmol/L。樣品溶液置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲藏,分別在0、10、24、48、72、144、288 h取一定量樣品溶液,測定活性物質(zhì)的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷腫16-17]。在室溫下,7.4 mmol/L ABTS與2.6 mmol/L K2S2O8等體積避光反應(yīng)12 h制備得到ABTS自由基(ABTS+·),利用pH7.4 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋50倍待用,100 μL樣品與175 μL ABTS自由基反應(yīng)6 min,測定在729 nm處的吸光度。ABTS自由基清除能力的計算公式如下:

式中,Ac為空白組(ABTS自由基與緩沖液反應(yīng));As為樣品組(ABTS自由基與樣品反應(yīng))。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Duncan(p<0.05)模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。使用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱變性對牛血清白蛋白與活性物質(zhì)間結(jié)合的影響

在溶液中,牛血清白蛋白的水合水分子在受熱時迅速耗盡,并發(fā)生疏水坍縮,從而導(dǎo)致構(gòu)象變化[18]。熱變性使得BSA熒光光譜的最大發(fā)射波長從343 nm藍(lán)移至331 nm(圖1A),表明色氨酸殘基和酪氨酸殘基的微環(huán)境變得更加疏水[19]。但是,hBSA的熒光強(qiáng)度減小到天然蛋白的62%(圖1A),與文獻(xiàn)中73 ℃熱變性的BSA熒光結(jié)果一致[19],這一現(xiàn)象可能是由于天然牛血清白蛋白中的兩個色氨酸殘基之間距離較小,相鄰熒光團(tuán)在受到熒光激發(fā)后發(fā)生了自淬滅[20]。熒光淬滅已廣泛用于研究蛋白質(zhì)和配體間反應(yīng)。通常,熒光淬滅率越高,親和力越強(qiáng)[21]。熱變性降低了α-生育酚或EGCG誘導(dǎo)的BSA熒光淬滅率(圖1B和C),即與蛋白的親和力。α-生育酚已被報道可以結(jié)合在BSA的子域ⅡA和ⅢA位點(diǎn)[22]。EGCG與天然BSA的結(jié)合位點(diǎn)位于子域Ⅰ和子域Ⅲ之間[9],在蛋白變性的過程中間隙的柔軟構(gòu)象最先發(fā)生變化[23]。熱變性破壞了BSA的天然配體結(jié)合位點(diǎn),但α-生育酚或EGCG仍可非特異性結(jié)合于hBSA。相反,熱變性提高了白藜蘆醇誘導(dǎo)的BSA熒光淬滅率(圖1D),即兩者間親和力。這與熱變性β-乳球蛋白與白藜蘆醇結(jié)合結(jié)果一致,可能是熱變性使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了重新排列,從而產(chǎn)生了新的白藜蘆醇結(jié)合位點(diǎn)[21]。相同濃度下活性物質(zhì)誘導(dǎo)hBSA熒光淬滅率排序?yàn)榘邹继J醇>EGCG>α-生育酚,表明hBSA與白藜蘆醇間親和力最強(qiáng)。

圖1 (A)2 μmol/L天然BSA與hBSA的熒光發(fā)射光譜以及(B-D)不同活性物質(zhì)誘導(dǎo)hBSA與天然BSA的熒光淬滅率

2.2 活性物質(zhì)與hBSA間的競爭結(jié)合

從圖2A-C可知,白藜蘆醇的加入對α-生育酚誘導(dǎo)蛋白熒光淬滅率幾乎沒有影響;EGCG則增強(qiáng)α-生育酚與hBSA的親和力。隨著EGCG濃度的升高,hBSA最大發(fā)射峰的位置從343 nm紅移至347 nm(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)),蛋白最大發(fā)射峰位置的紅移表明EGCG的結(jié)合使得hBSA更伸展,更有利于蛋白與α-生育酚間結(jié)合。α-生育酚和EGCG的加入對白藜蘆醇和hBSA的淬滅率幾乎沒有影響。EGCG與hBSA間相互作用也沒有受到α-生育酚和白藜蘆醇的影響。hBSA與α-生育酚、白藜蘆醇或EGCG在形成蛋白-二配體復(fù)合物的過程中無競爭現(xiàn)象,表明三種物質(zhì)結(jié)合在蛋白的不同殘基。為了實(shí)現(xiàn)hBSA與三種物質(zhì)的最大結(jié)合,先將EGCG加入,然后加入α-生育酚或者白藜蘆醇。如圖2D所示,EGCG、α-生育酚和白藜蘆醇的依次加入誘導(dǎo)蛋白的淬滅率為19%、31%和55%,與單一物質(zhì)誘導(dǎo)的蛋白熒光淬滅率相一致,表明hBSA可以同時結(jié)合EGCG、α-生育酚、白藜蘆醇生成蛋白質(zhì)-三配體復(fù)合物。

圖2 活性物質(zhì)與hBSA的競爭結(jié)合(A-C)以及三種活性物質(zhì)與hBSA相互作用的熒光發(fā)射光譜(D)

2.3 hBSA對活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)

2.3.1 hBSA對α-生育酚的保護(hù) 圖3為不同體系中α-生育酚殘留率隨儲藏時間的變化,殘留率為活性物質(zhì)在取樣時的殘留量與初始量的比值,殘留率越高表明活性物質(zhì)殘留量越多,結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。α-生育酚對光、熱、氧等敏感,易于發(fā)生氧化和降解[24],在儲藏48 h后其殘留率為43%,144 h后已完全降解。hBSA明顯地改善了α-生育酚的穩(wěn)定性,結(jié)果與β-乳球蛋白相似[25]。在儲藏288 h后,hBSA-α-生育酚復(fù)合物中α-生育酚的殘留率為66%。白藜蘆醇或EGCG對hBSA復(fù)合的α-生育酚的穩(wěn)定性沒有明顯影響。然而,白藜蘆醇和EGCG的共同加入改善效果較為顯著,在hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物中288 h后α-生育酚的殘留率為75%。

圖3 不同體系中α-生育酚在儲藏過程中含量的變化

2.3.2 hBSA對白藜蘆醇的保護(hù) 圖4為游離態(tài)及蛋白結(jié)合態(tài)白藜蘆醇在不同體系中殘留率隨儲藏時間的變化。在儲藏288 h后10 μmol/L白藜蘆醇的殘留率為24%,與30 μmol/L白藜蘆醇的穩(wěn)定性相比降解速度加快[9]。hBSA結(jié)合后加速了白藜蘆醇的降解,與文獻(xiàn)所報道的β-乳球蛋白和天然BSA對白藜蘆醇的影響一致[26]。在儲藏288 h后,hBSA-白藜蘆醇復(fù)合物中白藜蘆醇的殘留率僅為9%。α-生育酚的加入改善了hBSA復(fù)合白藜蘆醇的穩(wěn)定性,但是白藜蘆醇的殘留率仍低于游離態(tài)。然而,在hBSA-EGCG-白藜蘆醇復(fù)合物中白藜蘆醇?xì)埩袈蕿?7%,表明EGCG的加入消除了hBSA對白藜蘆醇穩(wěn)定性的負(fù)作用。這可能是由于蛋白復(fù)合減小了活性物質(zhì)的分子間距離,從而加強(qiáng)了EGCG對白藜蘆醇的作用[27]。α-生育酚的加入對hBSA-EGCG-白藜蘆醇中白藜蘆醇的穩(wěn)定性沒有顯著影響。

圖4 不同體系中白藜蘆醇在儲藏過程中含量的變化

2.3.3 hBSA對EGCG的保護(hù) 圖5為游離態(tài)及蛋白結(jié)合態(tài)EGCG在中性條件下不同體系中殘留率隨儲藏時間的變化。EGCG含有八個酚羥基的結(jié)構(gòu),在中性條件下極易發(fā)生氧化降解形成醌類物質(zhì)[28],在儲藏12 h后殘留率僅為10%,而hBSA-EGCG復(fù)合物中EGCG儲藏12 h后的殘留率為46%,表明hBSA-EGCG復(fù)合物的形成提高了EGCG的穩(wěn)定性。此外,α-生育酚和白藜蘆醇的加入對hBSA-EGCG復(fù)合物中EGCG的穩(wěn)定性無顯著影響。

圖5 不同體系中EGCG在儲藏過程中含量的變化

2.4 hBSA對活性物質(zhì)的抗氧化活性的保護(hù)

如圖6所示,在10 μmol/L時,hBSA對自由基的清除能力約為63%;α-生育酚、白藜蘆醇、EGCG自由基清除能力分別為6%、30%、46%;hBSA-α-生育酚、hBSA-白藜蘆醇、hBSA-EGCG復(fù)合物的自由基清除能力分別為69%、71%、75%。以上結(jié)果表明hBSA-活性物質(zhì)復(fù)合物的抗氧化活性強(qiáng)于蛋白或活性物質(zhì)。hBSA-α-生育酚復(fù)合物的抗氧化活性等于兩者的加和。hBSA-白藜蘆醇和hBSA-EGCG復(fù)合物的抗氧化能力則弱于兩者的加和,這種現(xiàn)象的發(fā)生是由于蛋白結(jié)合掩蔽了活性物質(zhì)的部分酚羥基[29],其中EGCG受到的掩蔽程度最為顯著。

圖6 α-生育酚、白藜蘆醇、EGCG及其混合物的游離態(tài)及蛋白結(jié)合態(tài)在儲藏過程中對ABTS自由基清除能力的變化

在儲藏過程中,hBSA的抗氧化活性未發(fā)生變化(圖6A)。在儲藏288 h后,游離態(tài)的α-生育酚、白藜蘆醇、EGCG對自由基的清除能力分別減少了6%、10%、31%,在蛋白復(fù)合后分別減少了5%、16%、16%。盡管EGCG在24 h即發(fā)生完全降解(圖5),但是降解產(chǎn)物依然保留著抗氧化活性(圖6A),可能是由于降解產(chǎn)物仍保留有酚羥基結(jié)構(gòu)[30]。已有文獻(xiàn)報道85 ℃熱變性β-乳球蛋白在144 h儲藏實(shí)驗(yàn)中,蛋白-EGCG復(fù)合物(蛋白與EGCG之間的摩爾比為1∶2)對DPPH自由基的清除能力減少了20%[31],hBSA對EGCG抗氧化活性的保護(hù)優(yōu)于熱變性β-乳球蛋白。hBSA則加速降低白藜蘆醇的抗氧化活性,但其影響小于hBSA對白藜蘆醇?xì)埩袈实挠绊?圖4)。

在儲藏288 h后,hBSA-α-生育酚-白藜蘆醇、hBSA-EGCG-α-生育酚、hBSA-EGCG-α-白藜蘆醇對自由基的清除能力分別減少了7%、15%、17%。與hBSA-單配體復(fù)合物相比,hBSA-兩配體復(fù)合物對抗氧化活性產(chǎn)生了更好的保護(hù)效果,并且消除了蛋白對白藜蘆醇抗氧化活性的負(fù)效應(yīng)。其中,雖然hBSA-α-生育酚-白藜蘆醇對α-生育酚和白藜蘆醇的穩(wěn)定性(圖3和4)沒有顯著性的保護(hù)效果,但是復(fù)合物的形成仍然對抗氧化活性產(chǎn)生了很好的保護(hù)效果。hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物對自由基的清除能力減少了13%,表明蛋白質(zhì)-三配體復(fù)合物對抗氧化活性的保護(hù)效果優(yōu)于兩配體復(fù)合物。

3 結(jié)論

活性物質(zhì)與hBSA之間親和力排序?yàn)榘邹继J醇>EGCG>α-生育酚,hBSA對活性物質(zhì)保護(hù)效果排序?yàn)棣?生育酚>EGCG>白藜蘆醇,親和力排序與保護(hù)效果相反。α-生育酚、白藜蘆醇或EGCG與hBSA的結(jié)合沒有受到相互間的競爭影響。此外,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性結(jié)果表明,hBSA顯著地改善了α-生育酚的穩(wěn)定性,hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物的形成進(jìn)一步提高了α-生育酚的穩(wěn)定性;雖然hBSA加速了白藜蘆醇的降解,但是hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物的形成消除了蛋白對白藜蘆醇穩(wěn)定性的負(fù)作用;hBSA提高了EGCG的穩(wěn)定性,hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物的形成依然對EGCG有保護(hù)作用。因此,hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物的形成對三者均有很好的保護(hù)效果。在抗氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),hBSA-EGCG-α-生育酚-白藜蘆醇復(fù)合物與游離態(tài)活性物質(zhì)比較,抗氧化穩(wěn)定性顯著提高。因此,hBSA是共包埋EGCG、α-生育酚、白藜蘆醇的良好載體