液態(tài)配方乳儲藏過程中物理性質變化的研究

馮曉涵,莊柯瑾,田 芳,毛穎異,陳 磊,趙艷榮,關 巖,*,姜毓君,*

(1.東北農業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030;2.雅培營養(yǎng)品上海研發(fā)中心,上海 200233)

牛奶因營養(yǎng)含量豐富,備受公眾青睞。隨著人們生活水平的提高及乳制品行業(yè)的快速發(fā)展,消費者對乳制品的品質要求有所提高[1]。液態(tài)配方乳是以乳類為主要原料,適量加入維生素、礦物質、多不飽和脂肪酸(如二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳四烯酸(AA)等)等成分制成的乳制品,從而滿足不同人群對營養(yǎng)的需求。

經超高溫滅菌處理的乳制品在室溫儲藏時的保質期可達6～12個月,在無需冷藏的條件下也可進行儲藏和運輸[2]。但是,在長期儲藏過程中易受到環(huán)境因素的影響誘發(fā)一系列物理、化學反應,使產品品質發(fā)生改變。除化學反應外,液態(tài)乳中物理性狀的改變對其品質和貨架期起到至關重要的作用,這些變化主要包括顏色變化、脂肪上浮、蛋白質沉淀和凝膠[3]。儲藏過程中美拉德反應的發(fā)生會導致產品顏色的變化,脂肪球的聚集促進脂肪向上移動浮于頂部[4]。沉淀和凝膠形成主要涉及乳中蛋白質的聚集,當強度足夠大時,就會在容器底部生成沉淀,在一定條件下會轉化成凝膠,因此,蛋白質分子的聚集是凝膠產生的第一個階段[4],同時也會使產品粒徑增大。凝膠的形成主要有兩個基本理論,一是酪蛋白被蛋白酶作用后發(fā)生分子重排,二是非酶作用,即物理化學變化后的蛋白質分子重排[5]。通常黏度在短時間快速升高,意味著將形成凝膠。

Richards等[6]研究低脂UHT乳在常溫下儲藏120～270 d的穩(wěn)定性,發(fā)現pH輕微下降,色差顯著增加。Malmgren等[5]評價UHT乳在5、22、30、40 ℃下儲藏六個月后的物理穩(wěn)定性,結果顯示所有溫度下UHT乳都出現顆粒聚集和蛋白質下沉現象。付莉等[7]研究發(fā)現液態(tài)配方乳在4～6 ℃儲藏時穩(wěn)定性較好。郭奇慧等[8]將UHT乳儲藏在25、40 ℃下,應用脂肪粒徑預測UHT乳貨架期。如上所述,國內外已有UHT乳儲藏穩(wěn)定性和貨架期預測的相關研究,但是針對液態(tài)配方乳的研究還相對較少,對其在不同儲藏條件下各物理性狀變化全面系統(tǒng)的研究則更少。并且在已有研究中,用于貨架期預測的指標并非篩選得到,而是研究者選定的某個指標。

本研究將液態(tài)配方乳置于不同儲藏溫度下定期檢測,研究長期儲藏過程中各項物理指標變化規(guī)律及儲藏溫度對其變化的影響,初步探討產生變化的原因,篩選具備貨架期預測潛力的指標。本研究旨在分析液態(tài)配方乳儲藏期內物理品質變化,為產品儲運條件的選擇、貨架期預測模型的建立提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液態(tài)配方乳 雅培營養(yǎng)品上海研發(fā)中心中試樣品;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氨水、無水乙醇、石油醚、無水乙醚、濃硫酸、H2O2、0.1 mol/L鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、95%乙醇、甲基紅、溴甲酚綠 國藥集團化學試劑有限公司;凱氏定氮消化片 丹麥福斯分析儀器公司;硝酸(超純)、30%雙氧水 美國J.T.Baker公司;甲醇 美國Fisher公司;質譜調諧液(1 μg/L) 安捷倫科技有限公司;元素標準溶液(鈣、鎂、鐵、鋅、磷混合標準品)、鍺標準內標溶液 o2si標準品公司。

Fisher Scientific AB150 pH計、烘箱 賽默飛世爾科技公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀 馬爾文儀器有限公司;DV2T粘度測定儀 美國博勒飛公司;ColorFlex EZ色差儀 美國HunterLab顏色管理公司;MS304S電子天平 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;WNB29水浴鍋 德國美墨爾特公司;PLC-RZ6毛氏離心機 北京朋利馳科技有限公司;ER-35S數顯恒溫電加熱板 上海慧泰儀器制造有限公司;凱氏定氮消化爐、Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司;7900 ICP-MS 安捷倫科技有限公司;MARS 6微波消解爐 美國CEM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 液態(tài)配方乳采用超高溫瞬時滅菌(140 ℃,5 s)工藝制備,制得樣品主要組成包括各宏量營養(yǎng)素,及維生素(維生素A、維生素E、維生素C等)、礦物質(鈣、磷、鎂、鐵、鋅等)、多不飽和脂肪酸(DHA)等微量營養(yǎng)素。其中各宏量營養(yǎng)素的含量為(/100 g):蛋白質2.8 g,脂肪4.9 g,碳水化合物6.9 g。將實驗室生產完成的液態(tài)配方乳轉入25、30、40 ℃樣品穩(wěn)定性測試儲藏室,在三種儲藏溫度下儲藏六個月,每間隔1個月取樣檢測。由于前期實驗結果顯示,液態(tài)配方乳在25 ℃和30 ℃儲藏時,樣品的變化程度相近,上下層脂肪和蛋白質含量無明顯變化。為比較儲藏溫度對脂肪上浮和蛋白質下沉情況的影響,上、下層脂肪和蛋白質含量、上層粒徑、下層礦物質含量只檢測儲藏溫度為25、40 ℃的樣品。用T25、T30、T40分別代表儲藏條件為25、30、40 ℃。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 pH 取80 mL樣品,放入轉子并置于磁力攪拌器上混和均勻,同時插入校正好的pH計進行測量,待數值穩(wěn)定后記錄pH。

1.2.2.2 粒徑和Zeta-電位 參照Nobuhara[9]方法,取10 μL樣品用磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L NaH2PO4,0.05 mol/L Na2HPO4,pH7.0)稀釋1000倍,搖勻后使用Zetasizer Nano ZS 馬爾文納米粒度電位儀測定樣品粒徑(平均粒徑)和Zeta-電位。分散相折射率為1.330,黏度為0.8872 cP,介電常數為78.5。

1.2.2.3 黏度 取200 mL樣品倒入特制燒杯中,選擇LV-01(61)轉子,設定轉速為100 r/min,使用DV2T粘度測定儀測定液態(tài)配方乳黏度。

1.2.2.4 顏色變化 參照Fernandez[10]方法,取20 mL樣品測量CIE參數L*、a*、b*,每次測量前分別進行儀器矯正及綠板測試。L*代表顏色亮(+)或暗(-),a*代表顏色紅(+)或綠(-),b*代表顏色黃(+)或藍(-)。結果用色差ΔE表示:

式中:ΔL*、Δa*、Δb*為每月測量值與0月測量值的差值。

1.2.2.5 上下層脂肪含量測定 樣品取出靜置48 h后,小心吸取上層及底層乳樣10 g,按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中第三法堿水解法進行測定。

1.2.2.6 上下層蛋白質含量測定 參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中第一法凱氏定氮法。取樣靜置48 h后,小心吸取上層及底層乳樣10 g于凱氏定氮消化管中,加入兩片凱氏定氮消化片,15 mL濃硫酸,5 mL H2O2,連接好排廢裝置,200 ℃消解1 h后升溫至420 ℃消解1.5 h,冷卻至室溫后于自動凱氏定氮儀上進行測定。

1.2.2.7 下層礦物質含量測定 參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》中第一法電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)。稱取0.5 g下層乳樣至于微波消解管中,加入0.5 mL鍺標準內標溶液,5 mL硝酸及2 mL雙氧水,放入微波消解爐消解。樣品消解完成后,加入20 mL超純水,轉移至50 mL容量瓶中,再加入0.5 mL甲醇,最后用超純水定容至刻度線,于ICP-MS(Agilent 7900)上機分析。ICP-MS分析條件如下:頻射功率為1550 W,采樣深度為6.5 mm,載氣為氬氣,流量為0.9 L/min,稀釋氣流量為0.2 L/min,蠕動泵轉速為0.1 r/s,清洗時間為360 s。

1.2.3 數據分析 實驗數據為三次實驗結果的平均值,使用Excel軟件處理實驗數據及圖表制作,結果表示為平均值±標準差。采用SPSS statistic 20.0軟件對數據進行方差分析、相關性分析及回歸分析。

2 結果與分析

2.1 液態(tài)配方乳pH變化

液態(tài)配方乳儲藏期間pH變化如圖1所示,由圖1可知,液態(tài)配方乳pH隨儲藏時間延長呈下降趨勢。隨儲藏溫度的升高,pH下降程度逐漸增大,液態(tài)配方乳儲藏5個月后,25、30 ℃時pH無顯著差異(p>0.05),而在40 ℃時,其pH下降最快,且從第三月開始顯著(p<0.01)低于其他兩個儲藏溫度的pH。這與Gaucher等[17]研究結果一致,Gaucher研究發(fā)現UHT乳在40 ℃下儲藏6個月后,pH由6.7下降到6.2,且明顯低于其它溫度,證明了儲藏溫度的升高加速pH下降。液態(tài)配方乳儲藏過程中,脂肪在氧氣的作用下發(fā)生脂肪氧化反應[11],生成游離脂肪酸、小分子有機酸等產物,會導致pH的下降。并且,有研究表明,隨儲藏溫度升高,氧化速率加快,游離脂肪酸等產物生成速率變快[12],這可能是pH在40 ℃時下降更快的原因。

圖1 液態(tài)配方乳儲藏期間pH變化

2.2 液態(tài)配方乳粒徑變化

液態(tài)配方乳儲藏期間粒徑變化如圖2所示,樣品在25、30 ℃儲藏4個月內,粒徑大小基本保持穩(wěn)定,從初始277.8 nm分別增加至283.9和288.3 nm,儲藏6個月時粒徑迅速增大,分別增加至312.9和332.1 nm。而在40 ℃儲藏6個月后,粒徑增加至382.5 nm,極顯著高于其他兩個溫度下樣品的粒徑大小(p<0.01)。實驗結果表明,粒徑隨儲藏時間延長而增大,同時也受到溫度的影響,這與郭奇慧等[8]的研究結果一致。由于液態(tài)配方乳屬于熱不穩(wěn)定體系,體系中分子會在布朗運動作用下發(fā)生碰撞合并,而溫度越高,外界提供的熱能越大,布朗運動越劇烈[13],粒子碰撞的效能及頻率增加,最后乳滴聚集,導致分子粒徑增大。另一方面,儲藏時間的延長，溫度的升高及儲藏過程中pH的下降也會促進蛋白質膠體中磷酸鈣的溶解,并從酪蛋白膠束中解離出來。解離出來的鈣離子可以與蛋白質絡合形成“鈣橋”,從而促進酪蛋白隨后的聚集,使粒徑增加[14]。

圖2 液態(tài)配方乳儲藏期間粒徑變化

2.3 液態(tài)配方乳Zeta-電位變化

Zeta-電位是分散體系穩(wěn)定性的重要指標,Zeta-電位的絕對值越大代表分散相穩(wěn)定性越高。液態(tài)配方乳儲藏期間Zeta-電位變化情況見圖3,由圖3可知,粒子所帶負電荷在0～6 月儲藏期內呈先增加后減少的趨勢,樣品在25、30 ℃儲藏3個月時,在40 ℃儲藏2個月時顆粒所帶負電荷最多。Thaddao等[15]在乳液儲藏過程中也觀察到顆粒所帶負電荷隨儲藏時間延長逐漸增加的現象,并認為脂肪氧化成生的游離脂肪酸及小分子有機酸主要分布在顆粒的油水界面上,并以COO-的形式存在于顆粒表面,使顆粒所帶負電荷增加[16]。

圖3 液態(tài)配方乳儲藏期間Zeta-電位變化

在儲藏后期,顆粒所帶負電荷逐漸減少,6個月后,樣品在40 ℃所帶負電荷為-16.5,顆粒所帶負電荷減少,分子間斥力降低,即分散相抗聚集的能力逐漸減弱[17]。推測其原因,可能是由于儲藏后期樣品顆粒變大,比表面積變小,顆粒表面可分布的COO-減少。Gaucher等[17]研究發(fā)現UHT乳在6個月儲藏期內Zeta-電位均約為-19,只有在40 ℃儲藏6個月后有輕微下降。本研究中得到的結果與之不同,這可能是由于液態(tài)配方乳中添加了較豐富的營養(yǎng)素,其配方體系的復雜性及營養(yǎng)成分的多樣性導致分散相穩(wěn)定性在儲藏過程中發(fā)生改變而表現出不同的結果。

2.4 液態(tài)配方乳黏度變化

乳液在儲藏過程中流動性的損失會使產品形成凝膠,主要表現為產品黏度的變化。液態(tài)配方乳儲藏期間黏度的變化如圖4所示,結果顯示,儲藏過程中黏度呈下降趨勢,樣品在25、30 ℃儲藏6個月后,其黏度略有下降,從最初的5.27 cP分別下降至4.88和4.97 cP,兩溫度之間無顯著差異(p>0.05)。在40 ℃儲藏6個月后,黏度下降至4.46 cP,極顯著低于其他兩個溫度(p<0.01),且黏度在40 ℃儲藏第一個月及儲藏后期下降速度較快,1～4月下降速度較緩慢。閆志國[18]研究發(fā)現,在儲藏初期產品黏度降低,隨后一段時間黏度基本保持穩(wěn)定,最后迅速上升,短期內形成凝膠。由于粘度的升高主要與蛋白質的高度聚集有關[5],而本研究中蛋白質在底層雖有輕微聚集,但沒有出現明顯沉淀及凝膠現象,所以并未觀察到液態(tài)配方乳黏度下降后再上升的過程,這與任龍梅等[19]的研究結果一致。

圖4 液態(tài)配方乳儲藏期間黏度變化

2.5 液態(tài)配方乳顏色變化

儲藏期間,乳中賴氨酸ε-氨基基團與乳糖發(fā)生美拉德反應,在美拉德反應的最后階段,中間產物經一系列變化最終生成棕褐色物質類黑精,使液態(tài)乳顏色發(fā)生改變[20]。本研究以ΔE來表示液態(tài)配方乳儲藏期間顏色的變化,結果見圖5。液態(tài)配方乳ΔE隨儲藏時間延長呈線性上升,且儲藏溫度越高,顏色變化速度越快,顯著性分析結果顯示,儲藏時間、儲藏溫度對ΔE影響極顯著(p<0.01)。液態(tài)配方乳在40 ℃儲藏6個月后,已經可以肉眼觀察到樣品產生了嚴重的褐變。有研究認為乳中顏色變化是由b*值引起的[17],實際上,本研究中液態(tài)配方乳顏色變化主要是由L*值和b*值共同作用的結果,L*值的降低說明樣品顏色逐漸變暗,b*值越大說明樣品顏色越偏向黃褐色,樣品在25、30、40 ℃儲藏6個月后,L*值由87.36分別降至84.58、83.15和80.23,b*值由13.41分別增加至14.64、15.93和19.08。這說明儲藏溫度越高,美拉德反應速率越快,液態(tài)配方乳褐變越嚴重,最終導致產品顏色改變。

圖5 液態(tài)配方乳儲藏期間ΔE、L*、b*變化

2.6 液態(tài)配方乳脂肪變化

通過測量液態(tài)配方乳儲藏期間上、下層脂肪含量來評價樣品脂肪上浮的情況,如圖6(A)所示,液態(tài)配方乳在25 ℃儲藏3個月后開始出現脂肪上浮的情況,儲藏6個月后上、下層脂肪含量分別為5.62和4.25 g/100 g且存在顯著性差異(p<0.05),樣品在40 ℃儲藏2個月后,上層脂肪含量呈線性快速增長,下層脂肪含量也略有下降,6個月后,上層脂肪含量高達11.54 g/100 g,說明液態(tài)配方乳儲藏溫度越高,脂肪上浮速度越快,這與王曉蘭等的研究結果結果一致[21]。如2.2中所述,隨儲藏時間延長及溫度上升,內部脂肪游離出來重新聚集成大分子脂肪球,浮于乳液表面,嚴重時可在頂部出現分層現象。Durand[22]研究發(fā)現脂肪球上浮速度與黏度有關,黏度越大,脂肪上浮速率越慢。根據圖4顯示,液態(tài)配方乳在40 ℃時黏度下降,使脂肪球遷移速率增加,進而導致脂肪快速上浮。上層脂肪粒徑結果見圖6(B),樣品在40 ℃儲藏6個月后,上層乳樣平均粒徑增加至446.4 nm,遠遠大于此時樣品平均粒徑382.5 nm,樣品粒徑越大,比重越小,向上運動速度越快,這也是脂肪球顆粒遷移、聚集,浮于頂層的有力證據之一。

圖6 液態(tài)配方乳儲藏期間脂肪及上層粒徑變化

2.7 液態(tài)配方乳蛋白質含量變化

配方液態(tài)乳經高溫處理會引起某些化學和物理變化,導致其儲藏穩(wěn)定性降低,可能會在容器底部形成蛋白質沉積物(沉淀)。本研究通過測量液態(tài)配方乳上、下層蛋白質含量評價其儲藏期間沉淀生成情況,結果見圖7。液態(tài)配方乳在25 ℃儲藏6個月后,上、下層蛋白含量(2.64 g/100 g和2.77 g/100 g)盡管從數值上看相差不大,但是其變化是顯著的(p<0.05),證明常溫儲藏時,液態(tài)配方乳中蛋白質聚集的速度較慢。而樣品在40 ℃儲藏1個月后,下層蛋白含量開始顯著(p<0.05)高于上層,且從第3個月開始與25 ℃存在極顯著差異(p<0.01),40 ℃儲藏6個月后上、下層蛋白含量分別為2.35 g/100 g和3.42 g/100 g。Lu等在全脂UHT乳儲藏120 d后也發(fā)現樣品上層蛋白質含量下降,下層蛋白質含量上升的現象[23]。

圖7 液態(tài)配方乳儲藏期間蛋白質變化

液態(tài)配方乳儲藏期間蛋白質分層現象的出現是乳液體系中正?，F象,40 ℃時下層蛋白質含量較高,可能與pH的變化有關,pH的降低會導致蛋白質分子間靜電斥力降低,破壞分子間各種作用力的平衡狀態(tài),此時靜電斥力較弱,范德華力占主導地位,液滴趨向于聚沉[24]。液態(tài)配方乳在40 ℃儲藏3個月后pH下降到6.52,因此,pH的下降可能是導致樣品在40 ℃時蛋白質分層較嚴重的原因之一,但是在整個儲藏期間,樣品底部沒有觀察到明顯的沉淀現象。

2.8 液態(tài)配方乳礦物質含量變化

乳中蛋白質是在各種離子組成的平衡體系中處于穩(wěn)定狀態(tài)的,當儲藏條件發(fā)生改變不能維持原有平衡時就會導致蛋白質聚集,生成沉淀。因此,本研究測量了液態(tài)配方乳下層乳樣中礦物質含量,結果見表1。隨儲藏時間延長,下層乳樣兒中礦物質含量呈上升趨勢,液態(tài)配方乳在40 ℃儲藏第2～3個月后,其下層礦物質含量開始與25 ℃存在顯著差異(p<0.05),這與下層蛋白質含量變化一致。因此,對下層礦物質與下層蛋白質含量進行相關性分析,結果見表2。40 ℃時,Ca、P、Mg、Fe、Zn含量與蛋白質含量極顯著相關(p<0.01),證明礦物質可影響蛋白質沉淀的生成。其中Ca含量與蛋白質含量相關系數最大,Boumpa[25]認為由于鈣離子促進了酪蛋白膠束的聚集,在熱處理過程中,當溫度大于100 ℃時,酪蛋白膠束中的膠體磷酸鈣開始溶解,并從酪蛋白膠束中解離出來,與蛋白質絡合形成“鈣橋”[26]。同時,儲藏過程中pH的下降也會促進膠體磷酸鈣的溶解,從而促進酪蛋白隨后的聚集[24]。由此推測Mg、Fe等礦物質在乳中也可形成與“鈣橋”類似的結構,進而影響蛋白質沉淀。

表1 液態(tài)配方乳儲藏期間下層礦物質含量變化Table 1 Change of minerals in liquid formula milk during storage

表2 液態(tài)配方乳下層蛋白質與礦物質含量相關性分析Table 2 Correlation analysis of protein and minerals content in the bottom of liquid formula milk

2.9 液態(tài)配方乳物理指標與儲藏時間回歸分析

為進一步評價儲藏過程中物理指標的變化情況,以儲藏時間為自變量,各物理指標為因變量,進行回歸分析,確定其反應級數,結果見表3。pH和黏度的下降遵循一級反應動力學,粒徑、色差、上層脂肪和下層蛋白的變化遵循零級反應動力學。在40 ℃時,各指標反應速率常數的絕對值皆較常溫時高,如pH和黏度在40 ℃時K值分別為25 ℃時的2.21和2.08倍,粒徑和色差在40 ℃時K值分別為25 ℃時的2.95和2.77倍,這說明不同指標在同樣的加速條件下對常溫下貨架期的預測關系是不同的,即各個指標具有不同的加速因子,在進行貨架期預測時不可一概而論。所有進行回歸分析的指標中,pH和色差隨儲藏時間的變化關系較密切。pH在各溫度下R2分別為0.822、0.866和0.995;色差在各溫度下R2分別為0.937、0.984和0.975。因此,pH和色差具備作為今后貨架期預測指標的潛力。另外,粒徑、上層脂肪、下層蛋白在40 ℃時R2分別為0.951、0.962、0.960,是可以用于判斷產品貨架期穩(wěn)定性的重要指標。

表3 液態(tài)配方乳物理指標與儲藏時間的回歸分析Table 3 Regression analysis of physical index and storage time of liquid formula milk

3 結論

本文研究液態(tài)配方乳在不同溫度下儲藏6個月內物理性狀的變化。從整個儲藏過程來看,液態(tài)配方乳在25及30 ℃下,各物理指標均相對穩(wěn)定。在40 ℃儲藏6個月時,pH、黏度呈下降趨勢,Zeta-電位呈先下降后上升的趨勢,粒徑、顏色變化、脂肪上浮、蛋白質沉淀皆呈上升趨勢。各項物理指標隨溫度升高,變化速度加快。相關性分析顯示,礦物質影響蛋白質沉淀生成?；貧w分析結果表明,不同指標在同樣的加速條件下對常溫下貨架期的預測關系是不同的,實際操作時需根據產品的配方特性篩選出適用的指標進行貨架期預測。液態(tài)配方乳營養(yǎng)成分復雜,在運輸及儲藏過程中遇到溫度過高的情況時,應注意其溫度的控制,盡可能減少儲運過程中產品品質的下降。