家蠶生物反應器表達A組輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7

王蓓蕾，孫愛群，李司

(浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院 浙江省家蠶生物反應器和生物醫(yī)藥重點實驗室，浙江 杭州 310018)

我國家蠶養(yǎng)殖歷史悠久，隨著經(jīng)濟發(fā)展我國家蠶養(yǎng)殖業(yè)逐漸現(xiàn)代化、科學化，每年可產(chǎn)蠶蛹30萬t，占世界年產(chǎn)量80%[1]。而浙江省有4 700余年的栽桑養(yǎng)蠶歷史，是全國蠶繭的主產(chǎn)省。自2000年蠶業(yè)管理改革以來，浙江省蠶繭產(chǎn)量最高可達9萬多t[2]，有著豐富的蠶業(yè)資源。家蠶不僅具有農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值，還具有食用和藥用價值[3]。由于家蠶安全性高，生產(chǎn)成本低，能表達具有天然活性的哺乳動物蛋白，使得家蠶生物反應器被廣泛地應用于科學研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，成為目前最有潛力的生產(chǎn)生物制品的昆蟲表達系統(tǒng)[4]。

輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科(Reovirdae)輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒和一些動物急性腸胃炎的主要病原體[5]。在我國，豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)分布范圍最廣，致死率高，傳染快，是公認的仔豬死亡“第一殺手”，每年對豬養(yǎng)殖業(yè)造成過百億的經(jīng)濟損失[6]。此外，A組輪狀病毒也會感染雞、牛等常見的家禽家畜以及嬰幼兒，不僅給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，還導致全球范圍內(nèi)約600萬嬰兒因RV感染而死亡[7]。由于RV主要感染胃腸道，因此，使得RV疫苗的研發(fā)一直朝著價廉、口服的方向努力，目前上市的RV疫苗均是口服毒活疫苗，我國自主研發(fā)唯一的RV疫苗是蘭州生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)的“羅特威”[8]。因此，RV疫苗的研發(fā)有著廣闊的前景，需要我們研究開發(fā)更加安全、簡單易行和經(jīng)濟實惠的輪狀病毒口服疫苗。

輪狀病毒屬于RNA病毒，含有11個節(jié)段的雙鏈RNA[9]。其中VP7蛋白是RV最外層的糖蛋白，含有能被細胞毒性T淋巴細胞識別的抗原決定簇，免疫原性強，可用作中和抗原[10]，因而是研究生產(chǎn)輪狀病毒基因工程疫苗的首選蛋白[10-11]。已有學者利用基因工程技術(shù)表達VP7蛋白，如文程等[12]將人源A組輪狀病毒VP7蛋白的全長基因通過PCR擴增后轉(zhuǎn)到表達載體pLA上，并將pLA-VP7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌中，成功地在干酪乳桿菌中表達了VP7蛋白，并通過Western blotting分析其具有良好的反應原性；張露等[13]成功地在大腸埃希菌中表達豬輪狀病毒VP7蛋白。但這些原核表達系統(tǒng)無轉(zhuǎn)錄后加工，使得表達的VP7蛋白缺乏糖基化。因此，昆蟲表達系統(tǒng)越來越受關(guān)注，Khodabandehloo等[14]將猴源輪狀病毒VP7克隆到苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)導入苜蓿銀紋夜蛾細胞，并成功地在注射VP7蛋白的兔子血清中檢測到了相應的抗體。相比于原核表達系統(tǒng)，昆蟲表達系統(tǒng)表達外源蛋白產(chǎn)生的抗體效價更高。

本研究構(gòu)建A組輪狀病毒的VP7重組家蠶桿狀病毒，分別在感染BmN細胞、家蠶5齡幼蟲以及蠶蛹中表達VP7蛋白，家蠶生物反應器具有以下優(yōu)勢：首先，與原核表達系統(tǒng)相比，增加了糖基化、磷酸化、酰基化等翻譯后修飾加工過程[15]，其高級結(jié)構(gòu)與天然相似，通過設(shè)計信號肽分子，能夠增加膜蛋白或分泌型蛋白的表達[16]；其次，家蠶本身具有高營養(yǎng)價值、食療保健功能、藥用價值等優(yōu)勢。此外，家蠶生物反應器原料豐富廉價易得，生產(chǎn)成本低。因此，利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)來表達A組輪狀病毒的VP7基因，可以經(jīng)濟、高效、快速地獲得大量安全的VP7蛋白，為研制新型的實用有效的A輪狀病毒疫苗提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶與蠶蛹購自浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司。BmN細胞、野生型家蠶桿狀病毒和家蠶細胞培養(yǎng)基由本實驗室提供。家蠶細胞培養(yǎng)基成分TC-100、胎牛血清(FBS)購自GIBCO BRL公司。轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司。一抗為VP7蛋白小鼠單克隆抗體購自重慶晶美公司。蛋白分子質(zhì)量Marker、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體、轉(zhuǎn)膜Buffer、ECL顯色液以及細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。醫(yī)用膠片、牛血清白蛋白、PVDF膜、酶標板、終止液等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-VP7的構(gòu)建

根據(jù)A組輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP7(GenBank：AF260941.1)序列，從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orFig.cgi得知，ORF框49～1 029，共981個密碼子，啟動子為ATG，終止子為TAG。由金維智生物科技有限公司合成，并將VP7序列與質(zhì)粒pBacPAK8構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-VP7。核苷酸序列如下：

1 ATGTATGGTA TTGAATATAC CACAATTCTA ATCTTTCTGA TATCAATCAT TCTACTCAAC

61 TATATATTAA AATCAGTGAC CCGAATAATG GACTACATTA TATATAGATT TTTGTTAATT

121 TCTGTAGCAT TATTTGCCTT AACTAAAGCT CAGAACTATG GACTTAATAT ACCAATAACA

181 GGATCAATGG ATACTGTATA CTCCAATTCT ACTCAAGAAG GAGTATTTCT AACATCCACA

241 TTATGTTTGT ATTATCCAAC TGAAGCAAGT AATCAAATCA GTGATGGTGA ATGGAAAGAC

301 TCATTATCGC AAATGTTTCT TACAAAAGGT TGGCCAACAG GATCAGTCTA TTTTAAAGAG

361 TACTCAAATA TTGTTGATTT TTCCGTTGAT CCACAATTAT ATTGTGATTA TAACTTAGTA

421 CTAATGAAGT ATGATCAAAA TCTTGAATTA GATATGTCAG AATTAGCTGA TTTGATATTG

481 AATGAATGGT TATGTAATCC AATGGATATA ACATTATATT ATTACCAACA ATCGGGAGAA

541 TCAAATAAGT GGATATCAAT GGGATCATCG TGTACTGTGA AAGTGTGTCC ACTGAATACA

601 CAAACGTTGG GAATAGGTTG TCAAACAACG AATGTAGACT CATTTGAAAC AGTTGCTGAG

661 AATGAAAAAT TAGCTATAGT GGATGTCGTT GATGGGATAA ATCATAAAAT AAATTTGACA

721 ACTACGACAT GTACTATTCG AAATTGTAAG AAGTTAGGTC CAAGAGAGAA TGTAGCTGTA

781 ATACAAGTTG GTGGCTCTAA TATATTAGAC ATAACAGCGG ATCCAACGAC TAATCCACAA

841 ATTGAGAGAA TGATGAGAGT GAATTGGAAA AGATGGTGGC AAGTATTTTA TACTATAGTA

901 GATTATATTA ATCAGATTGT ACAGGTTATG TCCAAAAGAT CAAGATCATT AAATTCTGCT

961 GCGTTTTATT ATAGAGTATA G

1.3 重組病毒BmNPV-VP7的構(gòu)建

用陳建博士的復制缺陷型穿梭載體RD-BmBacmid與重組載體pBacPAK8-VP7共轉(zhuǎn)染BmN細胞，以獲得重組病毒BmNPV-VP7。具體步驟如下：BmN細胞在24孔板中培養(yǎng)過夜。加0.3 μL RD-BmBacmid，1.5 μg pBacPAK8-VP7，1.5 μL轉(zhuǎn)染劑，100 μL無血清培養(yǎng)基與500 μL離心管中，混勻靜置15～30 min。將混合液加入細胞中，培養(yǎng)3～5 d。在細胞出現(xiàn)病變或者轉(zhuǎn)染120 h之后，將24孔細胞培養(yǎng)皿每孔中的上清液按體積比1∶100接種到新的裝有BmN細胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2～5 d并觀察細胞的病變情況。待細胞發(fā)病至破裂后，收集上清即重組病毒BmNPV-VP7，4 ℃保存。

1.4 VP7蛋白SDS-PAGE及Western blotting檢測

1.4.1 家蠶細胞樣品制備

用野生型家蠶桿狀病毒、重組病毒BmNPV-VP7分別感染家蠶細胞后培養(yǎng)3～4 d，待細胞發(fā)病收集細胞于15 mL離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，加入細胞裂解液，冰上裂解30 s，12 000 r·min-1離心10 min，收集蛋白。加2×Loading buffer，100 ℃金屬浴10 min。

1.4.2 家蠶樣品制備

野生型家蠶桿狀病毒、重組病毒BmNPV-VP7分別感染家蠶，喂養(yǎng)6～7 d后，待出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。收集家蠶血淋巴，后進行與家蠶細胞樣品制備同樣的細胞裂解和蛋白電泳步驟。

1.4.3 蠶蛹樣品制備

用野生型家蠶桿狀病毒和重組病毒BmNPV-VP7分別感染蠶蛹。第7天收集蠶蛹，用研缽研碎后，12 000 r·min-1離心10 min取上清，加入細胞裂解液，冰上裂解3 min，12 000 r·min-1離心10 min。加2×Loading buffer，100 ℃金屬浴10 min。

1.4.4 SDS-PAGE分析

先配置12%聚丙烯酰胺凝膠灌入膠板凝固后，配置5%的濃縮膠。等到膠凝固，進行電泳，蛋白Marker上樣5 μL，樣品上樣10 μL。濃縮膠恒壓90 V，分離膠100 V，電泳至Loading buffer接近1.0 mm垂直膠板下端即可。電泳結(jié)束，染色2 h，再進行脫色，每隔30 min換新的脫色液，直到條帶清晰即可。

1.4.5 Western Blotting檢測

用甲醇浸泡PVDF膜后，與濾紙一起在轉(zhuǎn)膜Buffer里浸泡15 min以上。電泳結(jié)束后將分離膠切割下來，在轉(zhuǎn)膜儀上先放8層濾紙，再放膜，再放膠，再放8層濾紙，2 mA·cm-2恒流電轉(zhuǎn)90 min。結(jié)束后，PVDF膜用TBS(5.84 g NaCl與10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl溶于900 mL去離子水，混勻后定容到1 L，調(diào)pH到7.4)洗3次，每次搖床上搖10 min。然后用3% BSA(3 g小牛血清白蛋白BSA溶于100 mL TBS)封閉，搖床搖1 h后，4 ℃平置過夜。用TBST(1 L TBS中加入10 mL Tween-20)1∶500稀釋的一抗(VP7蛋白的小鼠單克隆抗體)，搖床搖2 h或者4 ℃平置過夜。結(jié)束后，用TBST洗滌3次。再用封閉液1∶500稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體)，搖床上搖1 h。用TBST洗滌10 min，3次，再用TBS洗滌，每次5 min。洗完后4 ℃保存在TBS中，最后用ECL顯色液進行顯色。

1.5 VP7蛋白的ELISA檢測方法

1.5.1 家蠶細胞樣品制備

用野生家蠶桿狀病毒、重組病毒BmNPV-VP7分別感染家蠶細胞。在感染后的2～6 d收集細胞樣品，于15 mL離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，加入適量細胞裂解液，冰上裂解30 s，12 000 r·min-1離心10 min。取上清分裝，分別保存在-20 ℃和-80 ℃冰箱中。

1.5.2 蠶蛹血淋巴樣品制備

用野生家蠶桿狀病毒、重組病毒BmNPV-VP7分別感染蠶蛹，感染后的第2天開始收集蠶蛹，直接-80 ℃保存，直至第7天。將收集的各個天數(shù)的蠶蛹分別用研缽研碎后12 000 r·min-1離心10 min，分別取上清裝入15 mL離心管中，加入適量細胞裂解液，冰上裂解3 min，12 000 r·min-1離心10 min。再分別取上清分裝入EP管中，每個EP管中裝入每次實驗所需樣品的量，寫上標簽，一部分-20 ℃保存，另一部分-80 ℃保存。

1.5.3 ELISA檢測

取不同天數(shù)的細胞樣品和蠶蛹樣品，用包被液(2.93 g NaHCO3與1.59 g Na2CO3溶于900 mL去離子水再定容1 L)稀釋適宜的倍數(shù)。每孔100 μL包被酶標板，并設(shè)置陰性對照和空白對照，每個樣品重復3次， 37 ℃培養(yǎng)箱中溫育2 h，再放于4 ℃冰箱中18 h以上。用洗滌液PBST(1 L PBS中加入10 mL Tween-20)洗滌3次并拍干。每孔加300 μL 2% BSA(1 g BSA溶于50 mL PBS中)進行封閉，37 ℃封閉2 h。再用PBST進行洗滌，每孔300 μL，每次5 min，洗3次并拍干。接著每孔加一抗(VP7蛋白的小鼠單克隆抗體，用2% BSA溶液稀釋500倍)100 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱1 h。再用洗滌液PBST洗滌3次并拍干。然后每孔加二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體，用2% BSA稀釋1 000倍)100 μL，37 ℃溫育1 h。結(jié)束后用洗滌液PBST進行洗滌，每孔300 μL，每次5 min，洗3次并拍干。再每孔加底物100 μL 37 ℃顯色10～15 min。最后每孔加入終止液50 μL，用酶標儀測492 nm的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組病毒BmNPV-VP7的鑒定

經(jīng)基因測序重組病毒BmNPV-VP7的基因序列與預期序列一致，說明VP7基因已成功插入到家蠶桿狀病毒的基因組中。

2.2 VP7蛋白表達的SDS-PAGE與Western blotting分析

Western blotting結(jié)果(圖1)顯示，重組病毒感染的BmN細胞、家蠶血淋巴和蠶蛹樣品有且只有在35 ku一處信號帶，與輪狀病毒VP7蛋白大小相符，野生型病毒感染的樣品無信號帶，證明輪狀病毒VP7蛋白在家蠶細胞、家蠶5齡幼蟲以及蟬蛹中成功表達。

A，重組VP7蛋白在BmN細胞中表達的SDS-PAGE與Western blotting分析；B，重組VP7蛋白在家蠶5齡幼蟲血淋巴中表達的SDS-PAGE與Western blotting分析；C，重組VP7蛋白在蟬蛹血淋巴中表達的SDS-PAGE與Western blotting分析。M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，感染野生型病毒家蠶細胞；2，感染重組病毒家蠶細胞。圖1 重組VP7蛋白表達的SDS-PAGE與Western blotting分析

2.3 VP7蛋白表達的ELISA檢測分析

在家蠶細胞中，如圖2中A所示，我們可以觀察到，重組病毒感染的家蠶細胞樣品的吸光值顯著高于對照組野生型病毒感染的家蠶細胞樣品的吸光值，說明家蠶細胞表達了VP7基因，且VP7蛋白表達量隨時間遞增，在第5天達到最大，隨后遞減。在蠶蛹中，重組病毒感染的蠶蛹樣品的吸光值曲線與對照組野生型病毒感染的蠶蛹樣品的吸光值曲線差異較大，如圖2中B所示，VP7基因在蠶蛹體內(nèi)得到了表達，且VP7蛋白的表達量隨時間遞增。第7天從家蠶5齡幼蟲血淋巴細胞提取樣品，從圖2中C可以觀察到，在家蠶幼蟲中重組病毒感染的家蠶血淋巴樣品的吸光值高于野生型病毒感染的家蠶血淋巴樣品的吸光值，重組病毒在家蠶幼蟲中表達但表達量不高。從實驗結(jié)果可知，VP7蛋白的表達量與家蠶生物反應器的類型和感染時間有關(guān)，家蠶細胞宜在感染后4～5 d提取VP7蛋白，蠶蛹應在感染后7 d提取蛋白，感染7 d后蠶蛹的質(zhì)量狀態(tài)會下降，而家蠶5齡幼蟲不適宜用作VP7蛋白的表達反應器。這為家蠶生物反應器表達VP7蛋白，制備輪狀病毒免疫制劑提供技術(shù)指導。

A, 家蠶細胞中重組VP7蛋白表達水平的定量分析；B，蠶蛹血淋巴中重組VP7蛋白表達水平的定量分析；C，家蠶5齡幼蟲血淋巴中重組VP7蛋白表達水平的定量分析。圖2 VP7蛋白表達的ELISA檢測分析

3 小結(jié)與討論

本研究通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了VP7蛋白重組家蠶桿狀病毒，并在感染重組病毒的蠶蛹、家蠶細胞以及家蠶5齡幼蟲中成功表達了VP7蛋白，并比較了VP7蛋白重組家蠶桿狀病毒在這三類家蠶生物反應器中的表達量。家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)不僅具有表達量較高的優(yōu)點，而且作為真核表達系統(tǒng)，可對蛋白進行轉(zhuǎn)錄后修飾。此外浙江省是家蠶養(yǎng)殖大省，全省桑園面積約5.7萬hm2，蠶種年飼養(yǎng)量超過100萬張，蠶繭年產(chǎn)量約5萬t，有著豐富的蠶業(yè)資源[1]。因此，將家蠶作為生物反應器在安全性、有效性和成本等方面具有優(yōu)勢，為A組輪狀病毒的疫苗研究提供新的研究思路。以上研究結(jié)果為日后深入研究如何大規(guī)模制備A組輪狀病毒疫苗，并將其商業(yè)化生成安全有效的口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。