枯草芽孢桿菌Yz菌株丸化種衣劑配方篩選試驗(yàn)

羅振亞，徐 淑，林開春

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

【研究意義】棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，植棉業(yè)一直是我國農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，總產(chǎn)量居世界前列[1]。據(jù)記載，我國棉花病害有50多種，主要包括苗期、成株期、鈴期病害等[2]，常見病害有枯萎病、黃萎病、立枯病、紅腐病、炭疽病，其中立枯病、紅腐病、炭疽病是苗期常發(fā)性病害，易造成枯苗、死苗。目前，化學(xué)農(nóng)藥防治仍是控制棉花病害的主要手段，但化學(xué)農(nóng)藥長期大量的使用易產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題。近年來，隨著人們環(huán)保意識的提高，減少農(nóng)藥的使用、研制和開發(fā)生防菌劑已成為植保界和農(nóng)藥界共同關(guān)注的熱點(diǎn)[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis是防治植物病害的一種有效生防菌，抑菌范圍較廣泛[4-5]，其突出特征為生長速度快、營養(yǎng)簡單，耐熱抗逆性強(qiáng)且有利于生防菌的加工生產(chǎn)[6-7]。國外已有多個菌株獲得商品化生產(chǎn)許可，如GBO3、MBI600、QST713[8]和解淀粉枯草芽孢桿菌變種FZB24[9]，我國成功開發(fā)的制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、萎菌凈、亞寶等[10-11]。目前，市場上的枯草芽孢桿菌品種以可濕性粉劑、懸浮劑為主，使用方式為噴霧[7]。關(guān)于防治棉花病害的枯草芽孢桿菌丸化種衣劑以及配方篩選還未見相關(guān)報(bào)道。種衣劑以種子為載體，借助于成膜劑粘附在種子上，固化成為均勻的一層藥膜，不易脫落。種衣劑具有保護(hù)種子、提高出苗率、促進(jìn)幼苗生長、防治病蟲害、增強(qiáng)抗逆性等作用[12-15]。以生物種衣劑和生物復(fù)合種衣劑為代表的新型種衣劑，能減少農(nóng)藥用量，降低病原菌、害蟲產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景[16]。【本研究切入點(diǎn)】本研究在前期研究工作中，已從土壤中分離篩選到一株對棉花苗期病害有抑制活性的枯草芽孢桿菌Yz菌株。通過室內(nèi)生物活性測定，研究枯草芽孢桿菌Yz菌株對棉花苗期病害的抑制作用；并通過不同助劑的篩選，研制丸化種衣劑配方?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選對Yz菌株活性及對棉花種子發(fā)芽率影響較小的助劑，并確定各助劑的比例，為防治棉花苗期病害的生物型丸化種衣劑的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花品種為鄂棉23號（裸種），由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

供試菌株：棉花立枯病原菌（Rhizoctonia solani kuhn）、棉花炭疽病原菌 (Colletotricnum gossypii)、棉花紅腐病原菌 (Fusarium moniliforme和 F.graminearum)均由武漢天惠生物工程有限公司提供，于2004年保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究室?？莶菅挎邨U菌Yz菌劑發(fā)酵原粉（Bacillus subtilis）由武漢天惠生物工程有限公司提供，于2004年保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究室。

供試助劑：分散劑：十二烷基苯磺酸、NNO、拉開粉、木質(zhì)素磺酸鈉、XA-B，961。填料：糊精、膨潤土、硅藻土、高嶺土。粘結(jié)劑：羧甲基纖維素鈉、明膠、果膠、黃原酸膠、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌Yz菌劑原粉對棉花苗期3種病害的抑菌活性試驗(yàn) 采用對峙培養(yǎng)法，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板上的4個角點(diǎn)接上已經(jīng)培養(yǎng)好的指示菌菌塊，在28 ℃培養(yǎng)1～2 d后（根據(jù)病原菌的生長情況），將活菌數(shù)為990×108CFU/g Yz原粉用濃度梯度稀釋法依次稀釋50、102、103、104、105、106、107、108倍，取 5 μL稀釋菌懸液接于平板中央的雙層濾紙片上，每個濃度接4個培養(yǎng)皿，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至對照剛長滿整個培養(yǎng)皿后檢查結(jié)果，測量Yz菌株的菌落大小和抑菌圈大小，記錄拮抗活性和競爭作用的結(jié)果，以此判斷Yz原粉對指示菌的生物活性。

1.2.2 枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑不同類型助劑的篩選 將各種助劑分別與Yz原粉按照1∶1（W/W）的比例混合均勻，密封儲藏于54（±2）℃恒溫箱中14 d，以未加助劑的Yz原粉為對照藥劑，無菌水為空白對照，通過稀釋平板計(jì)數(shù)法測定其菌數(shù)的數(shù)量，通過測定菌數(shù)的下降率判斷各個助劑對Yz原粉生物活性的影響，進(jìn)一步篩選出對Yz原粉活性影響較小的助劑。

1.2.3 枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑配方的篩選 根據(jù)1.2.2試驗(yàn)結(jié)果，選擇幾種不影響Yz原粉生物活性的助劑，按照種衣劑用途分成填充料、粘結(jié)劑和分散劑3類。通過棉花盆栽試驗(yàn)，以種子發(fā)芽率為種衣劑配方篩選的主要評價(jià)指標(biāo)。進(jìn)行第一輪L9（33）正交試驗(yàn)，確定不同類型助劑的最佳成分。再經(jīng)過第二輪L9（33）正交試驗(yàn)，確定各個助劑的最佳用量，最終確定種衣劑的最優(yōu)配方。

1.2.4 棉花盆栽試驗(yàn) 將種衣劑粗產(chǎn)品進(jìn)行棉花種子包衣處理。棉種經(jīng)過硫酸脫絨后加稀堿溶液水洗至pH=7左右后，精選飽滿的種子，用枯草芽孢桿菌Yz菌劑原粉包衣后播于接入棉花立枯病菌的無菌沙（一根試管斜面病菌菌種接500 g無菌沙）中。無菌沙以塑料小碗分裝，每碗裝土300 g，每碗播15粒種子，置于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究室網(wǎng)室中。每個處理4次重復(fù)。并設(shè)為空白對照鄂棉23號（裸種），出苗后5～7 d調(diào)查出苗率和棉苗發(fā)病情況。

采用Excel（2007版）軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和正交數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌Yz菌劑原粉對棉花苗期3種病原菌的抑菌活性

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，Yz原粉50倍稀釋液對棉花立枯病原菌、棉花炭疽病原菌、棉花紅腐病原菌的校正抑菌圈直徑分別為10.07、15.54、8.96 mm。且隨著濃度的降低，Yz原粉對3種病原菌的抑菌圈也逐漸變小，不同濃度處理的抑菌圈直徑差異顯著。

表1 Yz原粉對棉花立枯病原菌、炭疽病原菌、紅腐病原菌的抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of antimicrobial activity experiments of Yz fermentation powder against cotton damping-off, cotton anthracnose, and cotton red rot

2.2 枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑不同類型助劑的篩選

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，經(jīng)54℃恒溫處理后，未添加任何助劑的Yz原粉活芽孢下降率為68.5%。添加分散劑十二烷基苯磺酸鈉、NNO、拉開粉、XA-B、961、木質(zhì)素磺酸鈉后，Yz原粉活芽孢下降率分別為70.80%、67.65%、67.60%、55.60%、60.50%、43.00%，各處理間差異顯著；添加填料糊精、膨潤土、硅藻土、高嶺土后，Yz原粉活芽孢下降率分別為40.00%、57.50%、45.80%、63.00%，各處理間差異顯著；添加粘結(jié)劑羧甲基纖維素鈉、明膠、果膠、黃原酸膠、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇后，Yz原粉活芽孢下降率分別為23.80%、61.40%、69.00%、54.30%、56.18%、71.86%、39.50%、22.50%，各處理間差異顯著。在實(shí)際操作過程中，糊精、聚乙烯醇因物理性狀過于粘結(jié)，在粉劑加工中較困難。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果以及各助劑的理化性質(zhì)，選擇以下助劑進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別為：填料（膨潤土、硅藻土、高嶺土），粘結(jié)劑（羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉），分散劑（木質(zhì)素磺酸鈉、XA-B、NNO）。

2.3 枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑助劑成分的優(yōu)化

各種助劑和Yz原粉混合好后進(jìn)行丸化種子包衣（填料：粘結(jié)劑：分散劑：YZ=3∶0.25∶0.3∶1），完成包衣后分別測定棉花種子發(fā)芽率。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，粘結(jié)劑對棉花種子的發(fā)芽率影響較大，當(dāng)組分為羧甲基纖維素鈉時(shí)，棉花種子的發(fā)芽率較高，極差為19.17；其次是分散劑，當(dāng)組分為木質(zhì)素磺酸鈉時(shí)，棉花種子的發(fā)芽率較高，極差為10.00；填料對棉花種子的發(fā)芽率影響相對較小，當(dāng)組分為硅藻土?xí)r，棉花種子的發(fā)芽率較高，極差為4.16。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，最終分別選擇硅藻土、羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉為助劑，進(jìn)入下一輪正交試驗(yàn)。

表2 各個助劑因子對Yz原粉生物活性的影響Table 2 Effects of various additives factors on the biological activity of Yz fermentation powder

表3 助劑種類正交試驗(yàn)L9(33)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal test design of additives L9(33) and the results

2.4 枯草芽孢桿菌Yz菌株發(fā)酵原粉丸化種衣劑助劑含量優(yōu)化

正交試驗(yàn)各個因子與水平的設(shè)置見表4。各種助劑和Yz原粉按表4設(shè)置的配比混合好后進(jìn)行丸化包衣，完成包衣后分別測定發(fā)芽率。試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，從極差R值可以看出，3個因素對棉花種子發(fā)芽率影響的大小依次為B＞C＞A，即羧甲基纖維素鈉對棉花種子發(fā)芽率的影響最大，其次分別為木質(zhì)素磺酸鈉、硅藻土。從各因素的不同水平看，A因素的第2個水平最好，B因素和C因素第1個水平最好。所以助劑最優(yōu)配方組合為A2B1C1，即Yz種衣劑的最優(yōu)配方為：A（硅藻土）∶B（羧甲基纖維素鈉）∶C（木質(zhì)素磺酸鈉）∶YZ=3.0∶0.8∶0.1∶1（W/W）。

表4 助劑配比優(yōu)化L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Orthogonal test design of optimization of the additives proportion L9 (33) and the results

3 討論

枯草芽孢桿菌是一類嗜溫性好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，其很多菌株都能產(chǎn)生豐富的抗菌物質(zhì)。眾多研究表明，枯草芽孢桿菌具有較好的抑菌作用，對蘋果輪紋菌、蘋果霉心病菌、炭疽病菌、紅霉病菌、尖孢鐮孢菌、水稻白葉枯病菌等均有明顯的抑菌活性［17-21］。本研究測定了枯草芽孢桿菌Yz菌株對棉花苗期3種病害的抑菌活性，結(jié)果表明Yz菌株對棉花立枯病、棉花炭疽病和棉花紅腐病均有較好的抑制活性，且Yz菌株原粉濃度越大，抑菌作用越明顯。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果類似?？莶菅挎邨U菌Yz菌株是從土壤中分離得到的，其發(fā)酵原粉與土壤的兼容性較好，可以在土壤中長期成活，持效性較好，將其開發(fā)成生物型種衣劑既能保護(hù)環(huán)境又能保護(hù)害蟲天敵，對維持生態(tài)平衡具有重要作用。

活體微生物較易受加工條件和環(huán)境因素的影響而失活，通常在微生物制劑加工過程中需要添加助劑以保護(hù)活性成分的有效性，延長商品制劑的貨架期［22］。但是，微生物制劑中的助劑可能對制劑的理化性質(zhì)以及微生物本身活性有較大影響，因此必須考慮助劑與活體微生物兩者的相容性［23］。本研究通過稀釋平板計(jì)數(shù)法研究了助劑與枯草芽孢桿菌的生物相容性，并通過正交試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌Yz菌株丸化種衣劑的助劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)粘結(jié)劑、分散劑、填料分別為羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、硅藻土?xí)r，棉花種子的發(fā)芽率較高；枯草芽孢桿菌Yz菌株種衣劑的最佳組合配方為：硅藻土∶羧甲基纖維素鈉∶木質(zhì)素磺酸鈉∶YZ=3.0∶0.8∶0.1∶1。魏嬌洋等［24］在制備解淀粉芽孢桿菌 X-278 片劑的過程中發(fā)現(xiàn)硅藻土為最佳載體，本研究結(jié)果與之類似。然而，孫朝華等［25］在對解淀粉芽孢桿菌TS-1203生防制劑研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)膨潤土為最佳載體。這種現(xiàn)象可能與不同生防菌生物學(xué)及其生物化學(xué)特性有關(guān)，不同微生物與載體的相容性不同。本研究僅對枯草芽孢桿菌Yz菌株的丸化種衣劑助劑進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，其在田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

4 結(jié)論

本研究通過抑菌圈試驗(yàn)，探討了枯草芽孢桿菌Yz菌株對3種棉花苗期病害的抑菌活性；并通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對助劑種類進(jìn)行了篩選，研制了其丸化種衣劑配方。Yz菌株對棉花立枯病、棉花炭疽病和棉花紅腐病均有較好的抑制活性，Yz菌株原粉濃度越大，抑菌作用越明顯。通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，篩選到3種最佳助劑，分別為羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、硅藻土，與枯草芽孢桿菌Yz菌株的最佳配比為：硅藻土：羧甲基纖維素鈉：木質(zhì)素磺酸鈉：YZ=3.0：0.8：0.1：1。篩選到的丸化種衣劑配方在田間的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步研究。