腫瘤免疫中CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作用研究

吳彬 梁華山 趙海霞 楊睿霞 郭亮

腫瘤免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)有效識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞的一系列正常生理過(guò)程。當(dāng)免疫系統(tǒng)識(shí)別、激活免疫應(yīng)答能力降低時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，擁有免疫無(wú)反應(yīng)性和免疫抑制兩大功能[1]。CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，具有抑制CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞活化、增殖的作用。叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，在細(xì)胞的分化和功能維持方面具有重要作用，是Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)記[2]。CD127與Foxp3 在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表面表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，選擇CD127low/-作為T(mén)reg 細(xì)胞標(biāo)記可排除CD25+的效應(yīng)性T 細(xì)胞，更真實(shí)反映Treg 細(xì)胞水平[3]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)癌癥患者與正常健康人群外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 比例，同時(shí)通過(guò)RTPCR 方法檢測(cè)Foxp3 表達(dá)情況，探討Treg 細(xì)胞在腫瘤免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年12月就診于我院的78 例癌癥患者，男45 例，女33 例；年齡39～87 歲，中位年齡51 歲，所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)，臨床分期根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，其中肺癌33例、胃癌12 例、結(jié)直腸癌10 例、乳腺癌8 例、多發(fā)性骨髓瘤7 例、非霍奇金氏淋巴瘤6 例，腎癌2 例。其中I～I(xiàn)I 期42 例，III 期20 例，IV 期16 例；入選者均未接受其他治療。對(duì)照組68 例，來(lái)自健康體檢人群，男38 例，女30 例；年齡35～72 歲，中位年齡45 歲。

1.2 主要試劑 FITC （Mouse Anti-Human） CD4 抗體、APC（Mouse Anti-Human）CD25 抗體、PE（Mouse Anti-Human）CD127 抗體、溶血素購(gòu)自美國(guó)BD 公司，PCR 試劑購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+CD127low/-Treg EDTA 抗凝管采集受試者空腹靜脈血3ml，取100μl全血標(biāo)本置于流式管中，分別加20μl 抗體，室溫避光孵育15min，加入500μl 溶血素避光孵育10min，加入鞘液2ml，1 500r 離心5min，棄上清，加500μl鞘液重懸細(xì)胞后上機(jī)。

1.4 real-time PCR 檢測(cè)Foxp3 表達(dá)情況 Foxp3上游引物：5'-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3'，下游引物：5'-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3'。參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 操作，反應(yīng)條件為：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s，共30 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞比例 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞的情況，如圖1 所示為一個(gè)典型特征結(jié)果，以前向散射光FSC 及側(cè)向散射光SSC 設(shè)門(mén)R1 選取淋巴細(xì)胞群，去除碎片；在CD4/SSC 圖上顯示R1 內(nèi)的細(xì)胞，選取CD4+細(xì)胞設(shè)門(mén)R2，在CD127/CD25 圖上顯示R2 內(nèi)的細(xì)胞，第二象限UL 為CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞占CD4+細(xì)胞比例為7.52%。癌癥患者與正常對(duì)照組相比，外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞比例為（5.89±1.74）%顯著高于正常對(duì)照組（2.17±0.93）%（t=-16.40，P＜0.05）。且不同分期實(shí)驗(yàn)組Treg 細(xì)胞比例也均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），其中III 期、IV 期癌癥患者Treg 細(xì)胞比例顯著高于I～I(xiàn)I 期患者（P＜0.05），III 期和IV 期癌癥患者Treg 細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.26）。見(jiàn)表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+CD127low/-Treg

表1 各組外周血CD4+CD25+CD127low/-Treg/CD4+T細(xì)胞比例（%）

2.2 外周血中Foxp3 表達(dá)情況 癌癥患者與正常對(duì)照組相比，外周血中Foxp3 相對(duì)表達(dá)量為（2.65±0.92）%顯著高于正常對(duì)照組（1.57±0.47）%（t=-9.06，P＜0.05），且不同分期實(shí)驗(yàn)組Foxp3 相對(duì)表達(dá)量也均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），其中IV 期癌癥患者外周血中Foxp3 表達(dá)顯著高于I～I(xiàn)I 期、III期患者（P＜0.05），I～I(xiàn)I 期和III 期癌癥患者外周血中Foxp3 表達(dá)無(wú)顯著差異（P=0.06）。見(jiàn)表2。

表2 各組外周血中Foxp3 表達(dá)情況

3 討論

在腫瘤入侵的最初階段，機(jī)體免疫系統(tǒng)可以通過(guò)免疫細(xì)胞及多種機(jī)制清除大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，使機(jī)體免疫處于平衡狀態(tài)；在適應(yīng)免疫系統(tǒng)后，腫瘤細(xì)胞通過(guò)變異突破免疫系統(tǒng)的限制，逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。腫瘤發(fā)生免疫逃逸的能力是腫瘤發(fā)生最相關(guān)的基本特征之一。

免疫細(xì)胞主要包括固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，而T 淋巴細(xì)胞與B 淋巴細(xì)胞即為適應(yīng)性免疫細(xì)胞。T 細(xì)胞中的Treg 細(xì)胞可以抑制免疫、控制自身免疫反應(yīng)，在腫瘤微環(huán)境中大量存在。Treg 細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制抑制T 細(xì)胞的活化和增殖。如Treg 細(xì)胞可以抑制APC 表面的MHC 分子和共刺激分子（CD80 和CD86），從而減弱APC 向T 細(xì)胞的抗原提呈作用；Treg 細(xì)胞可以分泌抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10、IL-35）并消耗γc 細(xì)胞因子，達(dá)到抑制T 細(xì)胞的活化和增殖的作用；Treg 細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶對(duì)T 細(xì)胞和APC 進(jìn)行殺傷等[4]。

Treg 細(xì)胞免疫表型為CD4+CD25+CD127low/-，通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤免疫調(diào)控，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，降低了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力，深入研究調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和腫瘤免疫之間的關(guān)系有助于進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移機(jī)制[5]。Foxp3 是Treg 的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg 發(fā)育和功能維持起著重要的調(diào)節(jié)作用。Foxp3 基因突變會(huì)導(dǎo)致Treg 發(fā)育和功能受損，發(fā)生免疫調(diào)節(jié)紊亂[6]。CD127 在具有免疫抑制作用的Treg 細(xì)胞中低表達(dá)，在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中可抑制同源激活T 細(xì)胞的能力，并在相同刺激下無(wú)自身作用[7]。Frederick 等[8]研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞在乳腺癌患者的腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著作用。Erin 等[9]認(rèn)為T(mén)reg 細(xì)胞對(duì)肺癌患者腫瘤微環(huán)境有影響，可抑制CD8+細(xì)胞的抗腫瘤能力，并且與環(huán)氧化物酶COX2 共同增強(qiáng)腫瘤的血管再生能力及侵襲能力。韓麗芳等[10]研究了肝細(xì)胞癌組織浸潤(rùn)Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與腫瘤免疫的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞通過(guò)抑制CD8+T 細(xì)胞增殖，分泌免疫抑制細(xì)胞因子IL-10 抑制肝癌的局部免疫，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究對(duì)78 例不同癌癥患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞及Foxp3 表達(dá)水平的分析證實(shí)，Treg 細(xì)胞可以較好的評(píng)價(jià)癌癥患者免疫狀況。不同癌癥患者者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞比例均顯著高于健康人群，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致[11～14]。同時(shí)可以看出，不同分期癌癥患者Treg 細(xì)胞比例有所差異，提示腫瘤疾病的發(fā)展與免疫水平的降低有相關(guān)性。正常細(xì)胞發(fā)生惡性突變后，進(jìn)一步誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞增多，而Treg 細(xì)胞又在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用，這種協(xié)同作用可能會(huì)導(dǎo)致癌癥進(jìn)一步進(jìn)展。因此，通過(guò)檢測(cè)外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg 細(xì)胞的數(shù)量可更好地評(píng)價(jià)患者的免疫情況，為癌癥的診斷與治療提供科學(xué)臨床依據(jù)。