廣東西番蓮莖基腐病病原的分離及鑒定

宋曉兵　崔一平　彭埃天　凌金鋒　程保平　陳霞

摘要：【目的】明確引起廣東西番蓮莖基腐病的病原菌，為有效防治該病害提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎媒M織分離法對廣東番蓮莖基腐病的病原進行分離，利用柯赫氏法則測定病原菌的致病性，光學(xué)顯微鏡觀察病原菌分生孢子的形態(tài)學(xué)特征，測序分析病原菌的rDNA ITS序列?！窘Y(jié)果】基于柯赫氏法則的致病性測定，證實從發(fā)病西番蓮莖基部主干分離獲得的病原菌對西番蓮具有致病性。BLAST在線比對分析結(jié)果顯示，病原菌rDNA ITS序列與多個腐皮鐮孢菌菌株的相似性在99%以上。結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征、致病性測定及rDNA ITS序列分析結(jié)果，可確定引起廣東西番蓮莖基腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌[Fusarium solani（Mart） Sacc）]。【結(jié)論】近年來引起廣東西番蓮莖基腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌。防治西番蓮莖基腐病需注重早期預(yù)防，提早防治;合理規(guī)劃種植，加強栽培;做好冬季清園，合理疏剪。

關(guān)鍵詞： 西番蓮;莖基腐病;腐皮鐮孢菌;分子鑒定;廣東省

中圖分類號： S436.67 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1007-06

Abstract：【Objective】The aim of the study was to clarify the pathogen causing stem rot of Passiflora Linn.， and provide a theoretical basis for effective prevention and treatment of the disease. 【Method】The pathogen was obtained by ti-ssue separation method， and the pathogenicity of the pathogen was determined by Koch’s rule. The morphological characteristics of the conidia of the pathogen were observed by optical microscope， and the rDNA-ITS ?sequence of the pathogen was analyzed by online BLAST. 【Result】Based on the pathogenicity measurement of ?Koch’s rule， it was confirmed that the isolated bacteria from the stem stalk was pathogenic to Passiflora Linn.. The BLAST online alignment showed that the similarity between the pathogen ITS sequence and those of multiple Fusarium solani strains was over 99%. Combined with the pathological characteristics of pathogen， the pathogenicity determination and sequence analysis of ITS， the pathogen causing stem rot of Passiflora Linn. was identified as Fusarium solani（Mart） Sacc. 【Conclusion】F. solani is the pathogen that can infect the base stem of Passiflora Linn. Controlling the stem rot of Passiflora Linn. requires early prevention， planning planting， strengthening cultivation， clearing garden and rationally cutting.

Key words： Passiflora Linn.; stem rot disease; Fusarium solani（Mart） Sacc; molecular identification; Guangdong

0 引言

【研究意義】西番蓮（Passiflora Linn.）又稱百香果、雞蛋果，果實具有較髙的食用和藥用價值（Antognoni et al.，2007;Zeraik and Yariwake，2010），目前商業(yè)栽培的品種主要有紫果西番蓮（P. edulis Sims）和黃果西番蓮（P. edulis var. flavicarpa Degener），在我國廣東、廣西、福建、臺灣和云南等省（區(qū)）均有種植（王秀榮等，2003;霍丹群等，2012）。近年來，隨著西番蓮規(guī)?；N植的普及，其病害問題日漸突出（嚴(yán)佳文等，2018）。2017—2018年在廣東省德慶縣大面積暴發(fā)西番蓮莖基腐病，田間表現(xiàn)為初期莖基部出現(xiàn)水漬腐爛癥狀，隨后植株逐漸枯萎、落葉，后期整株黃萎枯死，導(dǎo)致全園毀滅。鑒于西番蓮莖基腐病對廣東西番蓮產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重危害，非常有必要對其病原菌進行分子鑒定，明確廣東地區(qū)西番蓮莖基腐病的病原種類，為生產(chǎn)上防治該病害提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)對西番蓮莖基腐病的研究主要集中在病原鑒定、發(fā)生規(guī)律、種植栽培和化學(xué)防治等方面。鄭加協(xié)等（1992）、李德福等（1993）采用傳統(tǒng)分離鑒定法，分別將福建西番蓮基腐病病原鑒定為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum Schlecht）和腐皮鐮孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。詹儒林等（2003）采用常規(guī)鑒定法對海南瓊海西番蓮基腐病病原菌進行鑒定，根據(jù)形態(tài)特征和最適生長溫度將病原菌鑒定為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae Breda de Haan）。陳星等（2017）分離鑒定了廣西防城港西番蓮莖基腐病病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定結(jié)果，共獲得9個屬43個真菌分離物，致病性試驗證實病原菌為尖孢鐮孢菌。目前西番蓮莖基腐病的防治主要依賴殺菌劑，林泗海等（2015）建議在西番蓮植株莖基部涂抹500倍液的70%甲基托布津或50%多菌靈，可有效預(yù)防和控制西番蓮莖基腐病的發(fā)生;黃志巧等（2017）利用莖基部包裹澆藥法測定了4種藥劑對西番蓮莖基腐病的防效，結(jié)果表明，65%代森鋅和80%多菌靈對西番蓮莖基腐病有較好的防治效果?！颈狙芯壳腥朦c】前人研究結(jié)果表明，不同省份或地區(qū)的西番蓮莖基腐病原菌有所差異，但關(guān)于廣東西番蓮莖基腐病原鑒定及防治措施至今未見研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過組織分離法獲得廣東西番蓮莖基腐病的病原菌，利用柯赫氏法則測定病原菌的致病性，光學(xué)顯微鏡觀察病原菌形態(tài)特征，測序分析病原菌的rDNA ITS序列，并結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征和致病性測定確定廣東省西番蓮莖基腐病病原，為生產(chǎn)上防治西番蓮莖基腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品采集 2018年5—8月，分3次在廣東省德慶縣新圩鎮(zhèn)采集西番蓮莖基腐病病株。

1. 1. 2 試劑及培養(yǎng)基 AxyPrep基因組DNA試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物ITS1/ITS4由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

1. 2 病原菌分離純化

采用植物病原真菌常規(guī)分離法進行病原菌分離（方中達，1998）。切取患病西番蓮莖基部病健交界處的組織塊，經(jīng)75%酒精消毒1 min、0.1%升汞消毒2 min、無菌水漂洗3次后接種至PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 d待長出菌絲后，挑取菌落邊緣接種至PDA培養(yǎng)基進行純化，獲得的純培養(yǎng)物保存于PDA斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 病原菌致病性測定

1. 3. 1 離體接種 按照柯赫氏法則進行病原菌的致病性測定。將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，用直徑6 mm的打孔器打取菌絲塊。取健康的西番蓮莖用一次性醫(yī)用針頭輕輕刺傷表皮，然后將制備好的菌絲塊挑取至刺傷部位，菌絲正面倒置，置于鋪有3層紗布保濕的塑料密封盒內(nèi)。接種發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

1. 3. 2 活體接種 將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，以無菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生孢子，用血球計數(shù)板確定孢子懸浮液濃度，制備1.0×108個孢子/mL的分生孢子懸浮液。取健康的盆栽西番蓮用一次性醫(yī)用針頭輕輕刺傷莖基部的表皮數(shù)處，然后用手持噴霧器將制備好的分生孢子懸浮液噴施至西番蓮莖基部。接種發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

1. 4 病原菌形態(tài)特征觀察

將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃無光照條件下培養(yǎng)，定期觀察菌落的生長情況，并記錄菌落顏色、形態(tài)及生長情況;在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和分生孢子形態(tài)。

1. 5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用rDNA ITS序列分析方法對病原菌進行分子生物學(xué)鑒定。將病原菌接種至PDA液體培養(yǎng)基，置于28 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。滅菌濾紙過濾菌液，取適量的菌絲于滅菌研缽中，加入液氮研磨至粉末，參照Axyprep基因組DNA試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA。利用真菌rDNA ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。 PCR反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。運用DNASTAR對所獲得的基因序列進行比較分析，將基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，利用MEGA 6.0進行相應(yīng)序列的同源性分析，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病害田間癥狀

西番蓮莖基腐病主要受害部位為離地面5～10 cm的植株莖基部，染病初期在西番蓮莖基部出現(xiàn)褐色至深褐色病斑，然后病部皮層逐漸產(chǎn)生裂痕、變軟、腐爛，病部組織易與木質(zhì)部分離。染病后期莖部病斑橫向擴展環(huán)繞整個莖干，植株的枝蔓和葉片出現(xiàn)黃化、凋萎、落葉，果實逐漸萎縮、干癟，最后植株完全枯萎直至死亡（圖1）。

2. 2 病原菌致病性測定結(jié)果

分3次采集發(fā)病西番蓮莖基部主干，在實驗室對病部進行分離，均分離到同一形態(tài)真菌，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)典型的鐮孢霉屬真菌分生孢子，初步判斷為鐮孢霉屬真菌引起的病害。菌株離體接種致病性測定結(jié)果顯示，接種1 d后，接種部位開始出現(xiàn)水漬狀病斑，隨后病斑沿莖部呈條形擴展，最后整條枝條腐爛（圖2）。發(fā)病后從病斑上再次分離，獲得與接種病原菌相同的分離菌株。

菌株活體接種致病性測定結(jié)果顯示，接種40 d后，接種部位開始出現(xiàn)褐色病斑;接種50 d后病斑環(huán)繞莖基部，植株開始落葉;接種60 d后植株大部分葉片凋落，瀕臨枯死（圖3）。發(fā)病后從病斑上再次分離獲得與接種病原菌相同的分離菌株。

2. 3 病原菌形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃無光照條件下培養(yǎng)，其菌落圓形或橢圓形，初呈白色，后轉(zhuǎn)淺灰色，氣生菌絲薄絨狀，間有土黃色分生孢子座（圖4-a）。光學(xué)顯微鏡下可見典型的鐮孢霉屬真菌分生孢子，病原菌可產(chǎn)生大型分生孢子和小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀形，兩端較鈍，頂孢稍彎，具2～4個隔膜，壁較薄，大小為23.8～65.3 μm×3.2～5.6 μm;小型分生孢子呈卵形或橢圓形，大小為8.3～14.4 μm×2.5～3.8 μm（圖4-b）。

2. 4 病原菌分子鑒定結(jié)果

利用通用引物ITS1/ITS4可擴增獲得長度為542 bp的片段。將測序所得序列進行BLAST在線比對分析，發(fā)現(xiàn)分離獲得的西番蓮莖基腐病菌（F. solani strain XFL）的rDNA ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中多個腐皮鐮孢菌菌株對應(yīng)序列（登錄號KF751072、KM277969、JX435198和KM229694等）的相似性高達99%?；趓DNA ITS序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）顯示，西番蓮莖基腐病菌與腐皮鐮孢菌（F. solani）的多個分離物聚為一個分支，而尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）菌株（登錄號KC478639）和禾谷鐮孢菌（F. graminearum）菌株（登錄號MG670538）則聚為另一分支。通過形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性測定，可將分離獲得的西番蓮莖基腐病菌鑒定為腐皮鐮孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。

3 討論

鐮孢霉屬（Fusarium）又稱鐮刀菌屬，是真菌中難鑒定但具有經(jīng)濟價值的屬，該屬是由Link以粉紅鐮刀菌（F. roseum Link）為模式種建立（王桂清和馬迪，2017;高芬等，2018）。由于鐮孢霉屬真菌的多型性和易變異性，其分類鑒定仍然是真菌研究的重要難題之一（杜賓，2017）。鐮孢霉屬真菌的形態(tài)較復(fù)雜，以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)建立的分類系統(tǒng)難以進行準(zhǔn)確分類鑒定，單憑形態(tài)學(xué)特征的鑒定結(jié)果存在不確定性。采用分子生物學(xué)及測序技術(shù)，使DNA成為區(qū)分物種、變種和地理株的有效手段，為鐮孢霉屬真菌鑒定提供了更科學(xué)的方法（王世偉等，2018）。DNA條形碼技術(shù)作為一種新興的分子檢測技術(shù)已得到快速發(fā)展，越來越多學(xué)者利用DNA條形碼技術(shù)開展對鐮孢霉屬真菌分類系統(tǒng)發(fā)育的研究（Hebert et al.，2004;雷婭紅等，2016），尤其是多種基因位點如ITS和翻譯延伸因子（Nuclear translation elongation factor-1α，EF-1α）已廣泛應(yīng)用于鐮孢霉屬及種間的鑒定（曹雪梅等，2014）。本研究將形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，通過病原菌形態(tài)特征觀察、致病性測定和分子生物學(xué)鑒定，將分離獲得的西番蓮莖基腐病原菌鑒定為腐皮鐮孢菌，與李德福等（1993）的報道一致，為該病害的防治提供了理論依據(jù)。

對于鐮孢霉屬真菌引起的植物真菌病害，由于缺少有效的防治藥劑，一直以來都是防治難題，而且果園規(guī)模化種植單一品種又加劇了病害的擴散蔓延。目前關(guān)于西番蓮莖基腐病的防治研究較少，防治技術(shù)也較單一，主要依賴殺菌劑防治（林泗海等，2015;黃志巧等，2017），以及選用抗病品種、加強田間管理、增施有機肥等（盧桂玲和黃英晴，2017）。鄭繼華（2000）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，利用刷干預(yù)防的措施可有效防治西番蓮莖基腐病。當(dāng)前，尚缺乏西番蓮抗病育種、果園間作、高效栽培等方面的深入研究。每年5—7月是廣東西番蓮莖基腐病的發(fā)病高峰期，病原菌主要通過傷口從植株莖基部侵入，造成果園大面積暴發(fā)病害。西番蓮莖基腐病的防治應(yīng)以預(yù)防為主，提早防治，主要措施：冬季清除病原，冬季落葉后至萌芽前用石硫合劑全園噴施;加強栽培管理，增施有機肥和生物菌肥，增加土壤通透性;合理疏剪枝葉，保持果園通風(fēng)透光，改善果園陰蔽潮濕環(huán)境;早期藥劑防治，可選擇多菌靈、惡霉靈、咯菌腈和甲基托布津等，刮除病部后涂抹藥劑。

大面積種植單一品種會對病原菌產(chǎn)生定向選擇壓力，導(dǎo)致某些病害的流行與危害，而品種混合種植可抑制病害發(fā)展，利用種內(nèi)生物多樣性控制病害的研究日益得到廣泛關(guān)注（陳企村等，2009;黃沖等，2010;姜延濤等，2015）。許韜等（2014）研究田間混播種植26個小麥品種組合的抑病效果，其中對小麥白粉病有防治效果的組合占73.08%，相對防效為1.23%～56.65%。據(jù)筆者調(diào)研發(fā)現(xiàn)，廣東省紫果西番蓮發(fā)生莖基腐病較重，黃果西番蓮發(fā)病相對較輕，可能與不同品種的抗病性存在差異有關(guān)。建議在大面積推廣種植西番蓮的同時，考慮不同品種混種，以減少病害大暴發(fā)的概率。

4 結(jié)論

基于病原菌形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性測定，確定廣東西番蓮莖基腐病原菌為腐皮鐮孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。目前尚無防治西番蓮莖基腐病的有效藥劑，需注重早期預(yù)防，提早防治;合理規(guī)劃種植，加強栽培;做好冬季清園，合理疏剪;開展抗病育種、果園間作、高效栽培等研究。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）