溫度和白消安對星點(diǎn)東方鲀成魚生殖細(xì)胞枯竭的影響

任玉芹 趙雅賢 周勤 夏連軍 商木強(qiáng) 姜秀鳳

摘?要：為了解高溫和白消安注射對星點(diǎn)東方鲀（Takifugu niphobles）成魚生殖細(xì)胞發(fā)生的影響，設(shè)置32 ℃高溫組、32 ℃高溫-白消安組和空白對照組，比較3組的生長、存活率以及生殖細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，高溫-白消安組的體重、肥滿度顯著低于其他組（P<0.05），而全長與其他各組差異不顯著（P>0.05），各組的存活率均在90.9%以上。高溫-白消安組對生殖細(xì)胞的凋亡作用比高溫組更加明顯，卵巢基本看不到正常的生殖細(xì)胞，且有大量的吞噬作用造成的黃褐色沉積，生殖細(xì)胞凋亡造成的空白面積比例要顯著地高于高溫組（P<0.05）;精巢中生殖細(xì)胞凋亡的精小囊占總的精小囊的比例高達(dá)100.0%±0.0%，也顯著高于高溫組空泡精小囊占總的精小囊的比例（P<0.05）。得出結(jié)論：高溫-白消安組較高溫組更易誘導(dǎo)星點(diǎn)東方鲀內(nèi)源生殖細(xì)胞凋亡，從而可制備出生殖細(xì)胞移植的適宜受體。

關(guān)鍵詞：星點(diǎn)東方鲀（Takifugu niphobles）;高溫;白消安;生殖細(xì)胞;移植

我國養(yǎng)殖河鲀魚的總產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到5萬t以上。隨著2016年農(nóng)業(yè)部有條件開放紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）和暗紋東方鲀兩個(gè)養(yǎng)殖品種的加工經(jīng)營，將更大地促進(jìn)河鲀養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。相對于細(xì)膩鮮美的魚肉，被稱為“白子”（又稱之為西施乳）的雄魚精巢更是價(jià)格十倍于魚肉的奢侈品。帶有‘白子的雄魚售價(jià)是雌魚的1.5～2倍，并且在當(dāng)前的養(yǎng)殖模式下，全雄苗種還具有一定的生長優(yōu)勢[1]。所以全雄化技術(shù)開發(fā)是河鲀養(yǎng)殖業(yè)界的共識。傳統(tǒng)的全雄苗種培育技術(shù)路線是：通過雌激素誘導(dǎo)基因雄魚性轉(zhuǎn)化為偽雌魚（XY），偽雌魚與正常雄魚交配生產(chǎn)超雄（YY），YY 超雄魚與正常雌魚（XX）交配生產(chǎn)的后代全部為雄魚（XY）。如果沒有性別分子標(biāo)記而需要后代驗(yàn)證時(shí)，整個(gè)研究周期要經(jīng)過5代時(shí)間，即使借助分子標(biāo)記，這個(gè)過程也要經(jīng)過3代以上時(shí)間，對于河鲀養(yǎng)殖品種來說整個(gè)過程的完成要七年以上，嚴(yán)重阻礙了全雄魚苗種培育研究工作的開展。近年來魚類生殖細(xì)胞移植（Germ cell transplantation GCT）這一新興的生物技術(shù)研究的進(jìn)展為我們提供了全新的思路[2]，選擇適宜的受體可大大加快性別選擇育種的進(jìn)程。作為生殖細(xì)胞移植受體的前題條件是其生殖腺能夠支持供體的生殖細(xì)胞發(fā)育、增殖，同時(shí)滿足易養(yǎng)殖和易人工繁育的要求。

星點(diǎn)東方鲀（Takifugu niphobles）與紅鰭東方鲀同屬東方鲀屬，它們的種間遺傳距離很近，種間雜交后代存活并可育[3]。星點(diǎn)東方鲀最大生物學(xué)個(gè)體在50 g左右，僅為紅鰭東方鲀的1/150，性成熟期為一年，是十分適宜的河鲀生殖細(xì)胞移植受體魚。以成熟個(gè)體作為受體的必要條件是不存在內(nèi)源生殖細(xì)胞發(fā)生，但是具有正常功能的支持細(xì)胞（Brinster，2003）小生境（Niche）[4]。在哺乳動(dòng)物GCT實(shí)驗(yàn)中，通常采用化療藥物處理[5-6]、放射線照射[7]和高溫[8]。目前在羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、銀漢魚（Odontesthes sp.）[10]和斑馬魚（Danio rerio）[11]的研究中，利用高溫和白消安注射消除內(nèi)源生殖細(xì)胞制備生殖細(xì)胞移植受體，成功進(jìn)行了生殖細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，并獲得源自供體的功能配子或后代。在高溫條件下培育紅鰭東方鲀苗種，可引起生殖細(xì)胞的退化和凋亡[12]，但是尚無高溫配合白消安注射誘導(dǎo)星點(diǎn)東方鲀成魚生殖細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本研究中，初步觀察了高溫和白消安注射對星點(diǎn)東方鲀成魚生殖細(xì)胞發(fā)生的影響，以期為下一步生殖細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)提供適宜的受體。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚為2016年5-6月由北戴河金山嘴海域捕獲的星點(diǎn)東方鲀自然繁殖親魚。親魚收購后，全部養(yǎng)殖在北戴河中心實(shí)驗(yàn)站良種場。實(shí)驗(yàn)用魚在8月28日收容到試驗(yàn)水槽中，逐步升溫，使各試驗(yàn)水槽達(dá)到試驗(yàn)要求溫度。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)起始時(shí)間為2016年9月2日，設(shè)置1個(gè)空白對照組和2個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對照組（自然水溫，17.5～24.6 ℃），32 ℃高溫組和32 ℃高溫-白消安注射組（分別記錄為：C、HT 和HTB）。每組為一個(gè)300 L玻璃鋼水槽，各收容體重20 g以上成魚22尾，實(shí)驗(yàn)組由電加熱棒控溫水溫，流水培育，日流水量為4倍左右，每日投喂配合飼料兩次，吸污處理1次。

實(shí)驗(yàn)開始前，全部實(shí)驗(yàn)魚逐尾測量體重、體長，數(shù)據(jù)同歸為起始樣本S組。白消安在實(shí)驗(yàn)開始后的d 1，d 14，d 28按30 mg/kg的劑量進(jìn)行3次腹腔注射。注射前，用MS-222 （劑量100 mg·L-1）麻醉。最后一次注射5 d后完成全部實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為33 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，再次測量各組實(shí)驗(yàn)魚體重、體長。實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后各隨機(jī)取樣10尾，解剖采集性腺中部為樣本。性腺樣本用波恩氏液固定24 h后保存于體積分?jǐn)?shù)為70% 的酒精中。樣品采用石蠟切片，經(jīng)常規(guī)H.E.染色，在光學(xué)顯微鏡（ Olympus E-300 ）下觀察并拍照。

1.3?性腺組織學(xué)觀察

在組織樣中（雌雄樣n=3-5）做100左右的連續(xù)切片。卵巢發(fā)育分為Ⅰ-Ⅵ期;卵子發(fā)生時(shí)相分成卵原細(xì)胞期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、卵黃成熟期4個(gè)時(shí)相[13-16]。精巢發(fā)育分為Ⅰ-Ⅴ期;生殖細(xì)胞在發(fā)生上的順序依次為A型精原細(xì)胞、B型精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子6個(gè)時(shí)相[17-18]。組織形態(tài)學(xué)觀察參考Genten（2009）[19]。每個(gè)樣本選取5個(gè)典型的切片各拍攝30個(gè)數(shù)字圖片。卵巢性腺退化和生殖細(xì)胞凋亡的校準(zhǔn)參照Majhi（2009）[20]計(jì)算方法稍作變動(dòng)，使用Motic Images Plus 3.2 軟件截取一定面積計(jì)算空白無細(xì)胞的面積的比例。精巢性腺退化和生殖細(xì)胞凋亡的校準(zhǔn)參照Lacerda（2006）[9]計(jì)算方法，統(tǒng)計(jì)空泡精小囊與正常精小囊的比例進(jìn)行對比分析（圖1）。

1.4?數(shù)據(jù)處理

按照肥滿度=W（體重）×L-3（全長）公式計(jì)算每組的平均肥滿度。 根據(jù)組織學(xué)切片結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每組生殖細(xì)胞凋亡的平均比例;利用單因素方差分析比較每個(gè)組別之間體重、全長、肥滿度和細(xì)胞凋亡比例是否存在顯著性差異。

2?結(jié)果

2.1?生長、成活率

所有處理組在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過單因素方差分析和LSD多重比較各組生長情況見表1。全長與實(shí)驗(yàn)開始前的全長相比基本沒有變化。對照組C體重表型值、肥滿度均顯著高于開始前和其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.05），高溫HT組體重表型值、肥滿度與開始前體重表型值沒有顯著性差異（P>0.05），而高溫-白消安HTB組體重表型值、肥滿度均顯著低于開始前和其他兩組（P<0.05）。高溫白消安HTB組有8尾存在表皮潰瘍現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)沒有死亡，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第4天死亡2尾，成活率為90.9%。而空白對照組C和高溫組HT均無死亡現(xiàn)象。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列中有不同上標(biāo)小寫字母者表示不同實(shí)驗(yàn)水槽間差異顯著（P<0.05）。

2.2?溫度和白消安對卵巢發(fā)育的影響

在實(shí)驗(yàn)開始前，雌魚卵巢為Ⅱ期（見封三圖1A-B），卵巢中以卵原細(xì)胞和卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞為主。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，性腺發(fā)育良好，為Ⅲ期卵巢，以卵黃發(fā)生期卵母細(xì)胞為主，有部分為卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞，卵巢中見不到卵原細(xì)胞（見封三圖1C）;在放大圖中，可清晰看到卵膜和由扁平濾泡細(xì)胞組成的濾泡上皮（見封三圖1D）。實(shí)驗(yàn)開始前樣本和對照組卵巢一樣正常發(fā)育，卵巢腔由于受到擠壓而縮小。32 ℃高溫明顯抑制了卵巢的發(fā)育，卵巢腔由于卵母細(xì)胞的萎縮而增大，大部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)異常。卵黃發(fā)生前期卵母細(xì)胞由正常的噬堿性就成深藍(lán)黑色，而卵黃發(fā)生期細(xì)胞部分細(xì)胞核消失，部分卵母細(xì)胞還存在卵膜，但是所有的卵泡上皮都已潰散（見封三圖1E-F）。32℃高溫和白消安注射對生殖細(xì)胞的凋亡作用更加明顯，基本看不到正常的生殖細(xì)胞，并且有大量的黃褐色染色物存在，說明巨噬作用大量發(fā)生[10]。以放大圖為樣本計(jì)算卵巢切片截面（1 200 μm×800 μm）的無細(xì)胞空白面積比例。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見封三圖2）：起始樣本S和對照C組中，空白面積主要為卵巢腔，所占比例分別為：38%±1.0%和4.1%±1.0%，兩者之間沒有顯著性差異（P>0.05）。高溫HT組和高溫-白消安HTB組的空白面積包括細(xì)胞碎片和巨噬作用殘?bào)w等，空白面積所占比例分別高達(dá)58.6%±1241%和75.8%±1024%，均顯著高于起始樣本S和空白對照C組的空白面積比例（P<005），而HTB組卵巢的空白面積所占比例又顯著地高于HT組（P<005）。

2.3?溫度和白消安對精巢發(fā)育的影響

在實(shí)驗(yàn)開始前，雄魚精巢為Ⅱ期，精巢中以精原細(xì)胞為主（見封三圖3A-B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對照組C的雄魚精巢發(fā)育良好，此時(shí)為Ⅲ期精巢，生殖細(xì)胞以精母細(xì)胞為主，與實(shí)驗(yàn)開始前相比精原細(xì)胞大幅減少（見封三圖3C-D）。高溫HT組出現(xiàn)大量呈空泡狀的精小囊（見封三圖3E），同時(shí)依然存在充滿精母細(xì)胞的正常精小囊，精小囊邊緣零星分布著精原細(xì)胞（見封三圖3F）。高溫-白消安HTB組中，精原細(xì)胞全部消失，精小囊中的生殖細(xì)胞也全部凋亡。以放大圖為樣本計(jì)算切片截面（400 μm×600 μm）中無生殖細(xì)胞精小囊占總精小囊數(shù)的比例。起始樣本S不存在無生殖細(xì)胞精小囊，不作統(tǒng)計(jì)對比。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖4）：空白對照組C生殖細(xì)胞凋亡精小囊占總的精小囊的比例為32%±06%，有些明顯為切片操作引起的組織缺失。高溫HT和高溫-白消安HTB組誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡的精小囊占總的精小囊的比例分別高達(dá)872%±8.4%和100.0%±0.0%，均顯著高于空白對照C組的生殖細(xì)胞凋亡精小囊所占比例（P<005），而高溫-白消安HTB組誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡的精小囊所占比例又顯著地高于HT組（P<0.05）。

3?討論

在本研究中發(fā)現(xiàn)，32 ℃高溫條件下，對星點(diǎn)東方鲀生長和成活都沒有影響。但高溫和白消安組明顯引起實(shí)驗(yàn)魚表現(xiàn)出食欲下降和消瘦，且有約8尾魚（36.4%）體表出現(xiàn)潰瘍，并且在實(shí)驗(yàn)剛結(jié)束的37 d出現(xiàn)兩尾死亡。銀漢魚性腺枯竭實(shí)驗(yàn)也存在類似的現(xiàn)象[20-21]，25 ℃水溫下8個(gè)星期內(nèi)按照40 mg/kg劑量注射白消安2次，最終導(dǎo)致雌魚表皮出現(xiàn)潰瘍并且增加了死亡率。而該課題組進(jìn)而通過降低每次雌魚的白消安注射劑量最終避免了出現(xiàn)病理現(xiàn)象[10]。在Lacerda（2006）[9]的羅非魚實(shí)驗(yàn)中，白消安的最大注射劑量為18 mg/kg，總計(jì)注射2次，均低于本實(shí)驗(yàn)注射劑量和注射頻率，沒有發(fā)現(xiàn)表皮潰瘍和死亡。因此，推測實(shí)驗(yàn)過程中的生長和死亡率跟白消安劑量和注射頻率相關(guān)。而Suzuki（1995）[22]研究二甲基亞楓DMSO對虹鱒、銀漢魚、青鳉這三種魚的胚胎的毒理發(fā)現(xiàn)，高濃度的DMSO增加了這三個(gè)魚種的死亡率。所以也有觀點(diǎn)認(rèn)為白消安處理組的死亡率是由白消安的溶劑DMSO濃度引起。意識到DMSO潛在的危害性，一些學(xué)者在相似研究中均采用相對低濃度的DMSO溶解白消安，最終受體魚的死亡率都不大高[9，13，21，23-26]。今后有必要進(jìn)一步開展篩選適宜的白消安劑量和DMSO濃度，既能有效凋亡內(nèi)源生殖細(xì)胞又能保證制備出的受體魚體質(zhì)強(qiáng)壯。

GCT技術(shù)在種質(zhì)資源保護(hù)和商品魚繁育方面是非常有效的方法。通過植入消除內(nèi)源性細(xì)胞成魚體內(nèi)GCT能夠短時(shí)間內(nèi)獲得供體子代。此種方法可以較快地挽救瀕危物種和加快選擇育種進(jìn)程。在哺乳動(dòng)物和鳥類中，多次注射白消安、X - 射線或γ - 射線照射、高溫促使內(nèi)源性生殖細(xì)胞凋亡[5-8]。而魚類由于性腺位于腹腔中，用射線照射比較困難，如果通過外科手術(shù)暴露出來不大切合實(shí)際。所以在魚類中多采用通過高溫培育、多次注射白消安的方法進(jìn)行生殖細(xì)胞枯竭實(shí)驗(yàn)[9，13，21，23-26]。

高溫能夠促進(jìn)魚類生殖細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與羅非魚[9]、銀漢魚[21]、斑馬魚[11]和高身麗脂鯉[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，單因子高溫就可以引起星點(diǎn)東方鲀雌、雄魚的內(nèi)源生殖細(xì)胞的凋亡。在雄魚精巢中觀察到精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞凋亡，形成空泡狀精小囊，Lacerda（2006）[5]將其描述為僅有支持細(xì)胞的精小囊（Sertoli cell-only cysts），本實(shí)驗(yàn)高溫組空泡狀精小囊就可以達(dá)到87.21±842%。在雌魚卵巢中，我們可以觀察到大量的退化異常卵母細(xì)胞，細(xì)胞個(gè)體萎縮變小進(jìn)而引起卵巢腔的增大。然而De Alvarenga 研究與其他已發(fā)表的數(shù)據(jù)恰恰相反，發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚在相對較低一點(diǎn)兒的溫度下也能獲得生精細(xì)胞較高凋亡[27]。虹鱒魚[28]、麗脂鯉[23]、銀漢魚[21]在生長適宜溫度下性腺指數(shù)（GSI）沒有多大變化，而一旦轉(zhuǎn)入高溫組，GSI顯著地降低。一方面間接說明高溫引起了性腺生殖細(xì)胞的凋亡，另一方面也證明了高溫對受體魚性腺存有潛在的危害性。所以，今后有必要進(jìn)一步深入研究溫度對星點(diǎn)東方鲀性腺的影響。

以往的研究報(bào)道表明實(shí)驗(yàn)高溫配合白消安注射能有效加強(qiáng)對生殖細(xì)胞的凋亡作用[9，13，21，23-26]。在本研究中，高溫-白消安HTB組的卵巢空白面積和精巢中空泡狀精小囊比例均顯著高于高溫HT組（P<0.05）。在高溫HT組中（圖1F），部分卵母細(xì)胞的扁平濾泡上皮已經(jīng)潰散，卵母細(xì)胞由正常的噬酸粉紅色變?yōu)槭蓧A性的藍(lán)色，而在高溫-白消安組除去大部分生殖細(xì)胞已經(jīng)凋亡外，還出現(xiàn)大量巨噬作用產(chǎn)生的黃褐色染色物，其他魚類也有相似的報(bào)道[20，29-30]。我們是否可以推斷，高溫對雌、雄生殖細(xì)胞的作用是相同的，只是由于卵母細(xì)胞個(gè)體巨大，其退化潰敗有賴于巨噬細(xì)胞作用，這是一個(gè)需要時(shí)間的過程。

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Abstract：In order to study the effects of high temperature and busulfan injection on germ cell depletion of grass puffer，the growth，survival and germ cells apoptosis of grass puffers in 32 ℃ high temperature group （HT group），32 ℃ high temperature - busulfan group （HTB group） and control group were compared. The results showed that：In HTB group， the fish weight and fattiness were significantly lower than that of other groups （P<0.05），but the total length has no significant difference with that of other groups （P>0.05）.The survival rates of all groups were above 90.9%.The effects of germ cell apoptosis in HTB group were more obvious than that of the HT group，of which the normal germ cells of ovaries basic can not be seen.Furthermore，there were a lot of depositions of yellowish-brown caused by phagocytosis and the blank area ratio caused by germ cell apoptosis was significantly higher than that of the HT group （P<0.05）.The proportion of Sertoli cell-only cysts/seminiferous tubules caused by testis germ cell apoptosis in HTB group reached up to 100.0%±0.0% and was significantly higher than that of HT group（P<0.05）.Conclusion： It was relatively more easy to get recipients with a large number of endogenous germ cell apoptosis for germ cell transplantation in HTB group.

Key words：Grass puffer（Takifugu niphobles）; high temperature; busulfan; germ cell; transplantation