蛹蟲(chóng)草多糖硫酸化修飾及抗氧化研究

李婧婧 李爽 劉靜雪 李鳳林

【摘要】采用醇沉法結(jié)合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法對(duì)PCm進(jìn)行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖（SPCm）。紫外光譜分析顯示，SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰，說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。SPCm具有良好的抗氧化性，對(duì)DPPH自由基與超氧陰離子自由基均具有清除作用。

【關(guān)鍵詞】蛹蟲(chóng)草 多糖 硫酸化修飾 抗氧化

1材料與方法

1.1材料與試劑

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體，由吉林市匯豐科技公司提供;無(wú)水甲酰胺、氯磺酸、吡啶、氫氧化鈉溶液、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、氯化鋇、明膠、咔唑、半胱氨酸、鹽酸、葡萄糖、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、DEAE-纖維素、氮藍(lán)四唑（NBT）、還原型輔酶（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）、2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚（BHT）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛹蟲(chóng)草多糖的提取。將干蛹蟲(chóng)草進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩，粉末按30：1料液比加入水，80℃提取2h、離心10 min，取上清液，沉淀再重復(fù)提取3次，，合并上清液并過(guò)濾濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮到原體積1/5，然后以4︰1（v/ v）的比例加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h）、離心，沉淀依次無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，干燥后獲得粗多糖組份。

1.2.2蛹蟲(chóng)草多糖的純化。蛋白質(zhì)的去除選擇Sevag法。準(zhǔn)確稱(chēng)取蛹蟲(chóng)草粗多糖0.5g，加蒸餾水溶解至100 mL，加入Sevag試劑搖勻反應(yīng)12 min，離心除去蛋白層，反復(fù)多次，直至完全去除。濾液加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h），離心，沉淀用75%乙醇反復(fù)洗滌2次，獲得去蛋白后粗多糖。向去除蛋白的粗多糖溶液中加入氨水，調(diào)pH=8.5，然后滴加H2O2，溫度控制在40℃保溫，混均后會(huì)看到溶液顏色發(fā)生變化，至橙黃色時(shí)，停止滴加氨水和H2O2，靜置4h后，減壓濃縮，醇析，真空干燥后保存?zhèn)溆谩⒚撋侄嗵侨苡谡麴s水中制成5 mg/mL多糖溶液，上DEAE-纖維素柱，用蒸餾水按1.0 mL/min速度洗脫，每管，測(cè)每管（10 mL）多糖含量。將小峰去除，只收集最大峰，溶液經(jīng)蒸餾水進(jìn)透析袋透析48 h、干燥后得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份（polysaccharide from Cordyceps militaris，PCm）。

1.2.3硫酸酯化多糖的制備。將100mg PCm懸浮于10mL無(wú)水甲酰胺中，室溫?cái)嚢?5min，隨后加入2mL硫酸化試劑（氯磺酸和不同硫酸化反應(yīng)溶劑混合，比例按1﹕4配比）。在連續(xù)攪拌下將混合物在室溫下保持2h，然后在30℃保溫5 h。迅速冷卻至室溫后，用15%NaOH溶液中和，透析，濃縮并干燥，得到硫酸化多糖（Sulfation polysaccharide from Cordyceps militaris，SPCm）。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1硫酸化反應(yīng)的溶劑選擇：為確定適合的反應(yīng)溶劑，參考已知文獻(xiàn)，以取代度為指標(biāo)，選吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO為酯化反應(yīng)溶劑。

1.3.2紫外光譜分析：將PCm及SPCm加蒸餾水按1mg/mI濃度溶液，選取在190～400nm的波長(zhǎng)進(jìn)行紫外光譜分析，獲得紫外光譜圖。

1.3.3抗氧化能力確定：

（1）1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力。將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。用移液槍吸取1.0 mLSPCm加入2mL DPPH溶液（6.0mg DPPH溶解在100mL中甲醇），空白對(duì)照采用1.0 mL甲醇加入2mL DPPH溶液。緩慢搖晃使其混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對(duì)照，平行三次，取平均值。DPPH自由基的清除能力根據(jù)以下公式計(jì)算： 。式中：As-樣品吸光度;A1 -空白對(duì)照的吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

（2）超氧陰離子自由基（02-·）清除能力。首先將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。采用NBT-NADH-PMS方法測(cè)定超氧陰離子自由基。樣品管中依次加入1.0mL的NBT溶液（pH7.4），1.0mLNADH溶液（pH7.4）和0.1mL樣品溶液，再加入100μL PMS溶液，室溫反應(yīng)5 min，在560nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對(duì)照，平行三次，取平均值。

DPPH自由基的清除能力根據(jù)以下公式計(jì)算： 。式中：A-樣品吸光度;Ac -蒸餾水替代吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

1.4分析測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖，采用氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定取代度，計(jì)算公式如下：取代度（DS）=1.62/（32-1.02）S×100。式中：S-樣品中硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

2結(jié)果與分析

2.1不同反應(yīng)溶劑對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖取代度的影響

選擇吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲酰胺和二甲基亞砜（DMSO）作為反應(yīng)的溶劑，其對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖（SPCm）取代度的影響見(jiàn)圖1。圖1可以看出，以吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO作為反應(yīng)溶劑獲得對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖的取代度依次為1.22、1.17、0.86、0.43。因此選擇吡啶作為反應(yīng)最佳溶劑。其原因可能DMF、甲酰胺、DMSO極性都比吡啶弱，所以硫酸化衍生物的取代度都不大。

2.2蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖紫外光譜分析

蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖（SPCm）的紫外光譜見(jiàn)圖2，蛹蟲(chóng)草多糖（PCm）的紫外光譜見(jiàn)圖3.圖2、圖3可以看出，SPCm與PCm在220nm附近均有多糖的特征吸收峰;SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰，說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒(méi)有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發(fā)生輕微位移不明顯，說(shuō)明多糖在硫酸化過(guò)程中基本沒(méi)降解較。

2.3蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在0-0.2mg/mL劑量范圍內(nèi)，SPCm的DPPH自由基清除活性弱于BHT，但在不斷增加的濃度下，RAP的清除作用迅速趕上并超過(guò)BHT。濃度為0.25mg/mL時(shí)，SPCm與BHT的清除活性為的86.89%和80.45%。即SPCm對(duì)DPPH自由基具有良好的清除活性。

2.4蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPCm和BHT的超氧陰離子自由基清除活性隨著其濃度的增加而增加。在0.25mg/mL時(shí)，SPCm和BHT顯示74.62%和83.35%的清除活性，BHT比SPCm更有效。 結(jié)果表明，SPCm對(duì)超氧陰離子自由基具有較高的清除活性，但低于BHT。

3結(jié)論

采用醇沉法結(jié)合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法對(duì)PCm進(jìn)行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖（SPCm），獲得以下結(jié)果：

（1）吡啶作為反應(yīng)溶劑獲得對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖的取代度最高，是反應(yīng)最佳溶劑。氯磺酸一吡啶法是多糖硫酸化最理想的一種方法。

（2）糖紫外光譜分析顯示，SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰，說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒(méi)有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發(fā)生輕微位移不明顯，說(shuō)明多糖在硫酸化過(guò)程中基本沒(méi)降解。

（3）SPCm對(duì)DPPH自由基具有良好的清除活性。

（4）SPCm對(duì)超氧陰離子自由基具有較高的清除活性，但低于BHT。

基金項(xiàng)目：1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目《蛹蟲(chóng)草的多糖硫酸化修飾及抗氧化研究》[吉農(nóng)院合字（2018）第040號(hào)]2.吉林省教育廳十三五科技項(xiàng)目《蛹蟲(chóng)草多糖硫酸化修飾及其生物活性研究》[JJKH20180732KJ]。

第一作者簡(jiǎn)介：李婧婧，女（漢），吉林人，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)2016級(jí)本科生。通訊作者：李鳳林（1973-），男（漢），吉林人，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與分析。