玉米皮多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

徐彩紅 金渭荃 姜忠麗 閔鐘熳

(沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院,遼寧 沈陽 110034)

玉米皮是玉米淀粉深度加工的主要副產(chǎn)品,約占玉米干重的14%[1-2],營養(yǎng)成分十分豐富,一般含有3%～9%粗脂肪、3%～6%粗蛋白質(zhì)、25%～40%淀粉、20%～25%纖維素、35%～40%半纖維素,此外,還含有膳食纖維、甾醇酯和總多酚等多種活性成分。 這些營養(yǎng)物質(zhì)含量因玉米品種、品質(zhì)、淀粉加工技術(shù)及生產(chǎn)工藝的不同而有所差異[3-5]。 玉米皮中膳食纖維和多酚等活性成分在預(yù)防和治療一些疾病及在保健食品領(lǐng)域發(fā)揮著十分重要的作用[6-7]。 我國玉米皮年產(chǎn)量超過200 萬t,主要用于飼料行業(yè)或者直接廢棄掉,有效利用率偏低[1]。 因此,推進(jìn)玉米皮的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價值。

食源多酚具有抗氧化、抗炎、抗癌[8-9]等重要作用,因而一直是國內(nèi)外食源功能性成分研究的熱點(diǎn)。谷物食用部分的多酚含量較少,大部分多酚集中于谷物的麩皮中[10],其多酚類物質(zhì)受谷物的種類、加工方式等因素的影響而不同[11-12]。 目前,關(guān)于谷物源多酚生物有效性和生物活性方面的研究較少。 近年來,國內(nèi)外對玉米皮活性成分的研究集中在玉米皮膳食纖維和多糖方面[13-14],對玉米皮多酚類化合物(total phenolic of maize bran,MTP)的組成、含量、生物活性等方面研究報(bào)道較少[15]。 因此,研究MTP 對拓寬玉米皮的產(chǎn)業(yè)鏈和開發(fā)功能性新產(chǎn)品等具有重要意義。 目前,國內(nèi)外對MTP 的研究主要集中于玉米皮中阿魏酸、黃酮和黃色素3 種活性成分的提取,常用的提取方法有堿解法[16-18]、溶劑法[19-20]、微波協(xié)同酶法[21]和混合酶解法[22],但堿解法和溶劑法存在提取時間長,溶劑污染嚴(yán)重等問題。 而微波協(xié)同酶法采用微波系統(tǒng)纖維素酶水系統(tǒng)提取玉米皮黃色素,溶劑用量較少,提取率較高,對玉米皮功能性成分的提取具有一定的參考價值[15]。

木聚糖酶(xylanases,EC 3.2.1.8)是一類能夠水解木聚糖的酶系,因其具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)、較強(qiáng)的催化活性和較高的熱穩(wěn)定性,不僅被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙和飼料工業(yè),在改善面制品品質(zhì)、促進(jìn)低聚木糖和膳食纖維的生產(chǎn)及釀酒等食品工業(yè)中也有著巨大的應(yīng)用潛力[23]。 近年來,木聚糖酶在多糖、皂苷和多酚等生物活性成分提取方面的應(yīng)用也越來越多[15,24],但尚未檢索到采用木聚糖酶單酶水系統(tǒng)法提取MTP 的報(bào)道。因此,本試驗(yàn)采用中心組合(Central Composite Design,CCD)響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶提MTP 的工藝,并進(jìn)一步研究其抗氧化性,旨在為推動玉米皮的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮(市售,產(chǎn)自吉林乾安地區(qū))；沒食子酸(HPLC≥98%)、木聚糖酶(酶活力≥60 000 U·g-1),上海金穗生物科技有限公司；福林酚試劑(Foin-Ciocalteu 試劑),上海多烯生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipheny 1-2-picryl-hydrazyl,DPPH),梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),(上海)貿(mào)易有限公司；檸檬酸、無水碳酸鈉(分析純),天津博迪精細(xì)化工股份有限公司；石油醚(沸程60 ～90℃,分析純),天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 主要儀器

HY-2 型多用調(diào)速振蕩器,金壇市醫(yī)療儀器廠；SB25-12DTDN 超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；Avanti JE 型高效離心機(jī),貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司；T6 型分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米皮脫脂處理 粉碎粗玉米皮,過80 目篩,取一定量該玉米皮,加入4 倍質(zhì)量體積比的石油醚,室溫震蕩24 h 后抽濾,60℃低溫烘干濾渣,即得脫脂玉米皮。 密封,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 玉米皮多酚提取工藝 40℃預(yù)熱pH 值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,臨用前加入一定量的木聚糖酶混勻。 準(zhǔn)確稱量2.0 g 脫脂玉米皮與上述溶液混均,超聲(500 W),80℃水浴滅酶2 min,粗提液離心,收集上清液定容至100 mL,測定多酚含量。

1.3.3 總多酚含量的測定 采用Foin-Ciocalteu 比色法[25-27]。 取系列濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.50 mL于10 mL 棕色容量瓶中,加入1 mL Foin-Ciocalteu 試劑混勻,再加3 mL 8% Na2CO3溶液,定容后避光放置60 min。 以A760nm對沒食子酸質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= 0.068 9x+ 0.007 7,R2=0.999 3,線性范圍為1.12 ～8.96 mg·L-1。將稀釋至適量濃度待測樣品的A760nm值代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算樣品多酚的沒食子酸當(dāng)量。 參考文獻(xiàn)[27]的方法計(jì)算總多酚的提取量。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[27-28],以木聚糖酶添加量2.0%、超聲時間6 min、液料比40 mL·g-1、酶解溫度55℃為固定水平,考察各因素水平對MTP 提取量的影響。 其中,木聚糖酶添加量分別設(shè)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,液料比分別設(shè)為10、20、30、40、50、60 mL·g-1,酶解溫度分別設(shè)為45、50、55、60、65℃,超聲(500 W)時間分別設(shè)為2、4、6、8、10、12 min。 每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.5 玉米皮多酚最佳提取工藝的確定 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以酶添加量、超聲時間、酶解溫度和液料比為考察因素,采用Design-Exper 8.0.6 軟件進(jìn)行四因素五水平的CCD 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),篩選超聲輔助酶法提取MTP 的最佳工藝參數(shù)。 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table1 Design and factors of response surface experiment

1.3.6 MTP 提取物體外抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH·清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[29-30]的測定方法并略作修改。 將待測液稀釋至0.05～3.00 mg·L-1濃度范圍內(nèi),吸取該待測液2.0 mL,加入2.0 mL 0.2 mmol·L-1DPPH·溶液,渦旋30 s,室溫避光反應(yīng)60 min,以無水乙醇調(diào)零,測定517 nm 波長處的吸光度(As)；再以2.0 mL 樣品待測液與等體積無水乙醇混合后測定吸光度(Ab)；再測定2.0 mL DPPH·溶液與等體積無水乙醇混合后測定吸光度(A0),按照公式計(jì)算MTP 對DPPH·清除率：

1.3.6.2 ABTS+·清除能力的測定參照文獻(xiàn)[29,31]的方法。 取25 mL 7 mmol·L-1ABTS+·儲備溶液與440 μL 140 mmol·L-1過硫酸鉀溶液混勻,室溫避光反應(yīng)12 h,得ABTS+·溶液Ⅰ。臨用時以pH 值7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+·溶液Ⅰ,至其在734 nm的吸光度為0.700 ± 0.02,得ABTS+·溶液Ⅱ。取4.0 mL ABTS+·溶液Ⅱ,加入40 μL 樣品并混勻,室溫避光反應(yīng)6 min 后于734 nm 波長處測定吸光度值(As),按照公式計(jì)算MTP 對ABTS+·清除率：

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行處理；抗氧化性試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時間的確定 由圖1可知,固定超聲功率500 W,超聲時間在2～6 min 范圍時,MTP 的提取量增大,且與超聲時間呈顯著正相關(guān)(P＜0.01),此后MTP的提取量呈下降趨勢。 綜合考慮效率、環(huán)境等因素,選取超聲時間為6 min 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 超聲時間對MTP 提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction of MTP

2.1.2 酶解溫度的確定 由圖2可知,在45.0 ～55.0℃范圍內(nèi),隨著酶解溫度的升高,MTP 的提取量呈增加趨勢,當(dāng)酶解溫度超過55.0℃后,MTP 提取量顯著降低(P＜0.05),這可能是因?yàn)檫^高的酶解溫度導(dǎo)致了多酚類物質(zhì)的分解,故選取55℃為后續(xù)試驗(yàn)的最佳酶解溫度。

圖2 酶解溫度對MTP 提取量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction of MTP

2.1.3 木聚糖酶添加量的確定 由圖3可知,木聚糖酶添加量對MTP 提取量有明顯影響。 酶添加量在0.5%～2.0%范圍內(nèi),MTP 提取量增加并達(dá)到最大,且MTP 提取量與木聚糖酶添加量呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。 當(dāng)酶添加量大于2.0%后,MTP 提取量隨著酶添加量的增加而有所降低,這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锾幱诿革柡蜖顟B(tài)時,增加酶添加量不會使MTP 提取量增加。 因此,選擇1.0%～3.0%酶添加量做進(jìn)一步優(yōu)化研究。

圖3 木聚糖酶添加量對MTP 提取量的影響Fig.3 Effect of xylanase content on extraction of MTP

2.1.4 液料比的確定 由圖4可知,MTP 提取量隨著液料比的增大而增加,且與液料比呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)；當(dāng)液料比大于40 mL·g-1時,MTP 提取量逐漸降低(P＜0.01)。 液料比過小,MTP 提取量較小,提取不充分,而液料比過大,可能會降低提取效果。 因此,選擇液料比20～60 mL·g-1做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 液料比對MTP 提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction of MTP

2.2 玉米皮多酚提取工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,以多酚提取量為響應(yīng)值,對選取的4 個因素,進(jìn)行5 水平的CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸處理,得到二項(xiàng)式擬合的代碼方程為：Y=7.09+0.22X1+0.027X2+0.31X3+0.21X4+0.03X1X2+0.13X1X3-0.17X1X4-0.016X2X4-0.11X3X4-0.61X12-0.46X22-0.42X32-0.63X42。

回歸模型方差分析的結(jié)果見表3(P＜0.000 1)。由模型的R2=0.980 4 和可知,模型具有很好的擬合度；模型也具有很好的預(yù)測性；失擬項(xiàng)不顯著表明回歸方程對實(shí)際情況模擬度較高。 由各因素P值可知,對多酚提取量的影響極為顯著(P＜0.000 1),X1X3、X1X4和X3X4對多酚提取量的影響顯著(P＜0.05),影響大小順序?yàn)椋好柑砑恿?X3)＞超聲時間(X1)＞液料比(X4)＞酶解溫度(X2)。 因素間交互作用的影響為：X1X4＞X1X3＞X3X4,而X1X2、X2X3和X2X4對多酚提取量的影響不顯著。

響應(yīng)面有最高點(diǎn),說明在所選范圍內(nèi)存在極值；響應(yīng)值對因素條件的改變越敏感表現(xiàn)為響應(yīng)曲面坡度越陡峭[32-33]。 各因素交互作用越顯著表現(xiàn)為響應(yīng)面在底面的投影圖(等高線圖)的形狀越接近橢圓或鞍形；圖形越趨于圓形則說明因素間的交互作用越不顯著[34]。 由圖5可知,交互項(xiàng)X1X3(圖5-B)、X1X4(圖5-C)和X3X4(圖5-F)的等高線圖均趨于橢圓形,說明以上交互項(xiàng)的交互作用均顯著；其他交互項(xiàng)的等高線圖趨于圓形,其交互作用不顯著,這與表3方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of central composite design

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)所建立的模型預(yù)測得到最佳提取工藝條件為超聲時間6.51 min、酶解溫度54.70℃、酶加入量2.13%、液料比41.40 mL·g-1,此條件下,MTP 提取量的預(yù)測值為7.17 mg·g-1。 為驗(yàn)證模型的可靠性和實(shí)用性,依據(jù)經(jīng)濟(jì)和實(shí)際操作的可行性,確定最終試驗(yàn)條件為超聲時間6.50 min、酶解溫度55℃、酶加入量2.10%、液料比41 mL·g-1,按此工藝進(jìn)行3 次平行試驗(yàn),測得多酚的提取量為7.26 ± 0.15 mg·g-1,與理論預(yù)測值較接近,說明該回歸方程預(yù)測性良好。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Analysis of variance of the regression model

2.3 MTP 提取物體外抗氧化活性研究結(jié)果

2.3.1 MTP 提取物對DPPH·的清除能力 由圖6可知,在0.05 ～3.00 mg·L-1濃度范圍內(nèi),MTP 提取物對DPPH·清除能力與其濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),當(dāng)MTP 提取物濃度大于1.25 mg·L-1后,其對DPPH·的清除能力提高緩慢。根據(jù)IC50值可以確定清除自由基能力的強(qiáng)弱[30],MTP 提取物清除DPPH·的IC50值為0.48 mg·L-1,表明MTP 提取物具有很強(qiáng)的DPPH·清除能力。

2.3.2 MTP 提取物對ABTS+·的清除能力 由圖7可知,在0.05 ～6.00 mg·L-1濃度范圍內(nèi),MTP 提取物對ABTS+·清除能力隨著MTP 提取物濃度的增加而增強(qiáng),其濃度與自由基清除率具有顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)；MTP 提取物清除ABTS+·的IC50值為2.20 mg·L-1,表明MTP 提取物具有較強(qiáng)的ABTS+·清除能力。

3 討論

3.1 各因素對玉米皮多酚提取量的影響

本試驗(yàn)選用超聲輔助木聚糖酶水解法提取MTP,在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定超聲功率500 W,考察超聲時間、提取溫度、木聚糖酶添加量和液料比對玉米皮多酚提取量的影響。 結(jié)果表明,超聲具有使多酚類物質(zhì)從玉米皮細(xì)胞壁中溶出的能力,但是超聲時間過長,可能引起多酚類物質(zhì)的分解或氧化,導(dǎo)致多酚的提取量降低,因此,單因素試驗(yàn)中確定最佳超聲時間為6 min,酶解溫度范圍(45.0～65.0℃)選擇木聚糖酶酶活最適溫度(40.0～60.0℃)附近,此溫度范圍內(nèi)木聚糖酶均具有較高活力且酶活力相當(dāng),酶解溫度不會對多酚提取量產(chǎn)生較大影響[7]。 但酶解溫度大于木聚糖最適溫度(60℃)以后MTP 提取量會降低；酶與底物濃度在最適比時,將獲得滿意的提取效果,加酶量過小,MTP提取量偏低,加酶量過大,由于底物的飽和效應(yīng),也不會顯著增加MTP 提取量,反而導(dǎo)致浪費(fèi),經(jīng)優(yōu)化得到木聚糖酶的最適添加量為2.10%；液料比增加,多酚的提取量有所降低,其原因可能是隨著料液比的增加,溶劑體積增加使木聚糖酶濃度降低,酶解效果減弱,導(dǎo)致多酚提取量降低。

圖5 因素交互作用對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of the interaction between factors on extraction of polyphenols from maize bran

3.2 MTP 提取物抗氧化活性分析

圖6 MTP 提取物濃度對DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of MTP extract concentration on DPPH·scavenging rate

圖7 MTP 提取物濃度對ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effect of MTP extract concentration on ABTS+·scavenging rate

多酚的特性和抗氧化機(jī)理不同,單一類型的檢測方法不能反映出系統(tǒng)中所有物質(zhì)的抗氧化情況,因此,組合不同檢測方法可以獲得系統(tǒng)中多種化合物的抗氧化響應(yīng)信息[35-36]。 DPPH·和ABTS+·清除能力是體外抗氧化能力評價中廣泛采用的指標(biāo)。這2 個指標(biāo)均可采用分光光度計(jì)定量分析,操作簡單快捷,結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠。 DPPH·清除能力測試原理是DPPH·結(jié)構(gòu)中含有一個孤對電子,當(dāng)加入自由基清除劑時,該孤對電子被配對,深紫色的DPPH·被還原成黃色非自由基形式,其褪色程度與所接受的電子數(shù)量呈定量關(guān)系[27]。ABTS+·清除能力測試原理是在一定濃度范圍內(nèi),根據(jù)抗氧化劑提供的電子或氫原子可滅活A(yù)BTS+·,從而使其溶液顏色發(fā)生變化[28,30]。

不同抗氧化劑與DPPH·或ABTS+·反應(yīng)的速率不同,反應(yīng)到達(dá)平衡的時間也不同。 為了避免抗氧化性評價產(chǎn)生偏差,不能將反應(yīng)時間固定在某一數(shù)值。 抗氧化劑與DPPH·或ABTS+·的反應(yīng)濃度應(yīng)適宜,過高或過低都會直接影響反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 因此,本試驗(yàn)充分考察了MTP 測試濃度、反應(yīng)時間等關(guān)鍵影響因素,最終確定DPPH·或ABTS+·清除率測定時,一定濃度MTP 提取物與DPPH·或ABTS+·試劑的加樣體積比分別為1 ∶1 和1 ∶100,反應(yīng)時間分別為60 min 和6 min。 在本試驗(yàn)研究濃度范圍內(nèi),MTP 對DPPH·和ABTS+·均具有較強(qiáng)的清除能力,且MTP 提取物濃度與自由基清除率均具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

谷物多酚分為結(jié)合型和游離型,兩種類型的多酚對自由基清除率不同,多酚對自由基清除率的貢獻(xiàn)率因谷物不同而有所差異[35]。 玉米粉多酚(包括藍(lán)玉米粉、紫玉米粉、花玉米粉等)具有較強(qiáng)的抗氧化能力和保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的自由基抑制作用,但因玉米品種而異,其主要成分(原花青素、阿魏酸等)的含量也有所差異,導(dǎo)致其抗氧化能力存在差別[36]。 目前,國內(nèi)外對MTP 的抗氧化性鮮有報(bào)道。 Inglett 等[7]對玉米皮(粒徑＞30 μm)經(jīng)50%乙醇二次浸提后得到的MTP 進(jìn)行抗氧化能力研究,其DPPH·清除能力為15.66 μmol Trolox·g-1。 以Trolox 為對照,本試驗(yàn)提取的MTP 為結(jié)合型和游離型的混合型多酚,對DPPH·清除能力為46.50 μmol Trolox·g-1。 因試驗(yàn)條件不同,很難從不同的體外抗氧化試驗(yàn)研究結(jié)果直接比較化合物的抗氧化能力[7,35],但也可推測出本試驗(yàn)采用的木聚糖酶水解法提取的MTP 較乙醇浸提法具有更好的抗氧化能力。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲輔助酶法提取玉米皮多酚,基于單因素試驗(yàn)考察不同因素對MTP 提取量影響的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到優(yōu)化的提取工藝條件為：酶添加量2.10%、酶解溫度55℃、液料比41 mL·g-1、超聲時間6.50 min,此條件下MTP 提取量為7.26 ± 0.15 mg·g-1,與理論預(yù)測值(7.17 mg·g-1)較接近。 MTP 提取物對DPPH·和ABTS+·均具有較強(qiáng)的清除能力,且抗氧化活性與其濃度在一定范圍內(nèi)有很好的量效關(guān)系,MTP 提取物IC50值分別為0.48、2.20 mg·L-1。綜上表明MTP 可作為潛在天然抗氧化劑應(yīng)用于食品行業(yè)。