基于紫外—紅外指紋圖譜的淫羊藿根、莖及葉質量研究

徐玉玲， 楊茂春， 姚運秀， 雷燕莉， 鄭榮蕾

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

淫羊藿又名仙靈脾、剛前，是小檗科淫羊藿屬植物，始載于《神農本草經》，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，在我國具有悠久的藥用歷史[1-2]，臨床上常用來治療骨質疏松、股骨頭壞死以及性功能障礙等疾病[3-6].淫羊藿于1963年被收入《中國藥典》，其藥用部位為莖葉，《中國藥典》1977年版更改其藥用部位為地上部分，《中國藥典》2010年版又更改其藥用部位為干燥葉，并沿用至今，而在《中藥大辭典》中，淫羊藿與淫羊藿根則被分為兩種藥材.由此可見，淫羊藿原植物藥用部位變化比較大，而據(jù)相關文獻報道，不同藥用部位某些成分含量有差異[7-8].事實上，中藥所含成分復雜，幾個成分還不足以反應其內在質量差異，指紋圖譜可從整體上反映中藥的物質基礎情況，具有特征性、重現(xiàn)性和可操作性，能同時對多種成分進行質量控制與差異分析，常用于中藥質量控制[9-11].為分析淫羊藿根、莖、葉的質量差異，本研究采用紫外分光光度法(UV)[12-14]和紅外光譜法(IR)[15-17]對箭葉淫羊藿與柔毛淫羊藿的根、莖、葉等部位的指紋圖譜進行差異研究分析，擬為中藥材不同用藥部位的質量差異研究提供一種新的思路.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用藥材包括：箭葉淫羊藿10批(批號，0928J1、0928J2、0928J3、0928J4、0928J5、0928J6、0928J7、0928J8、0928J9、0928J0)、柔毛淫羊藿10批(批號，0319R1、0319R2、0319R3、0319R4、0319R5、0319R6、0319R7、0319R8、0319R9、0319R0)，均采自四川達州，經成都大學藥學與生物工程學院劉濤教授鑒定均符合《中國藥典》(2015版一部)中的規(guī)定，為正品.藥材采收時間為2017年8～9月，取全株，去除泥土，洗凈，放置于50 ℃條件下干燥，根、莖、葉分別粉碎，過50目篩，避光保存?zhèn)溆?

實驗所用試劑包括：溴化鉀(批號，20170526)，購自天津卒越化學品有限公司；水為純化水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)，KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A-2004型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司).

2 方法與結果

2.1 淫羊藿藥材不同部位UV指紋圖譜的研究

2.1.1 樣品的制備.

分別取淫羊藿藥材不同部位粉末(根、莖、葉)約0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精密移取續(xù)濾液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，制得稀釋50倍的供試品溶液.

2.1.2 UV光譜測定條件.

精密移取70%乙醇0.5 mL于25 mL容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，作為空白校零溶液.UV光譜掃描條件為光譜帶寬2.00 nm，掃描范圍為200～400 nm，光度模式為Abs，掃描間隔1.0 nm.

2.1.3 方法學考察.

1)精密度.按照“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下的光譜掃描條件連續(xù)掃描6次.選擇波峰225、270、318 nm與波谷217、250、301 nm波長處的吸光度值并計算RSD，分別為0.42%、0.48%、0.50%、0.59%、0.52%、0.32%，表明儀器精密度良好.

2)穩(wěn)定性.按照“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下的光譜掃描條件，于供試品制備完后0、1、2、3、4、5 h各掃描1次.選擇波峰225、270、318 nm與波谷217、250、301 nm波長處的吸光度值并計算RSD，分別為1.16%、1.07%、1.45%、1.08%、1.17%、0.91%.結果表明，供試品溶液在5 h內穩(wěn)定性良好.

3)重復性.按照“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液6份，按“2.1.2”項下的光譜掃描條件每份掃描1次.選擇波峰225、270、318 nm與波谷217、250、301 nm波長處的吸光度值并計算RSD，分別為0.95%、0.94%、0.86%、0.84%、0.85%、0.88%.結果表明，方法重復性良好.

2.1.4 UV圖譜采集.

分別取箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)粉末各10批，按照“2.1.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下的光譜掃描條件進行掃描，得10批箭葉淫羊藿和10批柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)的疊加指紋圖譜.

2.1.5 UV對照指紋圖譜的建立.

將10批箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)的吸光度平均值分別做對應的淫羊藿不同部位(根、莖、葉)對照指紋圖譜的吸光度，得到相應的UV對照指紋圖譜并疊加在一起，其結果如圖1所示.由圖1可知，藥材樣品的吸光度整體值大小依次為葉、根、莖.

2.1.6 相似度分析.

對10批淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)之間的UV對照指紋圖譜進行相似度分析，并經數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關“pearson”分析計算相似度，結果見表1.

圖1兩種淫羊藿不同部位的UV對照指紋圖譜疊加圖

表1 淫羊藿樣品的UV對照指紋圖譜相似度分析

由表1可知，箭葉淫羊藿與柔毛淫羊藿樣品的根、莖及葉的UV對照指紋圖譜相互之間的相似度均高于0.97.數(shù)據(jù)說明，藥材樣品的根、莖、葉的70%乙醇提取液中所含化學物質種類基本相同.

2.2 淫羊藿藥材不同部位IR指紋圖譜的研究

2.2.1 光譜掃描條件.

將淫羊藿藥材樣品薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描測定.掃描范圍4 000～450 cm-1，掃描時扣除H2O和CO2的干擾.

2.2.2 樣品溴化鉀薄片制備條件.

分別取淫羊藿藥材樣品不同部位粉末(根、莖、葉)約0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，分別取續(xù)濾液20、100、200、500 μL，置于潔凈瑪瑙研缽，揮干，加入溴化鉀約0.1 g，研勻，將細粉全部移至壓片模具中，于壓強為14 MPa的壓片機中保持1 min，取出，按照“2.2.1”項下光譜掃描條件掃描，結果如圖2.

由圖2可知，當所取續(xù)濾液為500 μL時，掃描所得圖譜中有較多且明顯的峰.據(jù)此可確定藥材樣品溴化鉀薄片制備方法為：取淫羊藿藥材不同部位粉末(根、莖、葉)約0.1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液500 μL，置于潔凈瑪瑙研缽，揮干，加入溴化鉀約0.1 g，研勻，將細粉全部移至壓片模具中，于壓強為14 MPa的壓片機中保持1 min，取出，制得樣品溴化鉀薄片.

圖2 4種藥材樣品溶液的IR圖譜

2.2.3 方法學考察.

1)精密度.按照“2.2.2”項下的方法制備藥材樣品溴化鉀薄片，按“2.2.1”項下的光譜掃描條件連續(xù)掃描6次.選擇圖譜中波數(shù)為1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1處較明顯的6個峰，計算各個峰透光率的RSD，分別為0.63%、0.31%、0.26%、0.22%、0.21%、0.07%.結果表明，儀器精密度良好.

2)穩(wěn)定性.按照“2.2.2”項下的方法制備樣品溴化鉀薄片，按“2.2.1”項下的光譜掃描條件，于樣品溴化鉀薄片制備完后0、1、2、3、4、5 h各掃描1次.選擇圖譜中波數(shù)為1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1處較明顯的6個峰，計算各個峰透光率的RSD，分別為2.57%、2.89%、2.96%、3.25%、3.41%、4.36%.結果表明，樣品在5 h內穩(wěn)定性良好.

3)重復性.按照“2.2.2”項下的方法制備樣品溴化鉀薄片6份，按“2.2.1”項下的光譜掃描條件每份掃描1次.選擇圖譜中波數(shù)為1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1處較明顯的6個峰，計算各個峰透光率的RSD，分別為1.75%、1.84%、2.59%、2.23%、2.59%、3.39%.結果表明，方法重復性良好.

2.2.4 IR圖譜采集.

取箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)粉末各10批，按照“2.2.2”項下的方法制備樣品溴化鉀薄片，按“2.2.1”項下的光譜掃描條件進行掃描，得10批箭葉淫羊藿和10批柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)的疊加IR指紋圖譜.

2.2.5 IR對照指紋圖譜的建立.

將10批箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)的透光率平均值分別作對應的淫羊藿不同部位(根、莖、葉)IR對照指紋圖譜的透光率，得到相應的IR對照指紋圖譜，疊加在一起，結果見圖3.

圖3兩種淫羊藿不同部位的IR對照指紋圖譜疊加圖

2.2.6 相似度分析.

對10批淫羊藿藥材樣品不同部位(根、莖、葉)之間的IR對照指紋圖譜進行相似度分析，并經數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關“pearson”分析計算相似度，結果見表2.

表2 淫羊藿樣品的IR對照指紋圖譜相似度分析

由表2可知，箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品的根、莖及葉的IR對照指紋圖譜相互之間的相似度大部分高于0.90，最低為0.873.數(shù)據(jù)表明，藥材樣品的根、莖、葉的70%乙醇提取液中所含化學物質種類基本相同.

2.2.7 IR對照指紋圖譜的峰形分析.

對箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品不同部位的IR對照指紋圖譜進行峰值檢出，結果如圖4所示.

圖4淫羊藿藥材樣品的IR對照指紋圖譜峰值檢出

由圖4可知，箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品的根、莖及葉于1 310 cm-1、1 260 cm-1、1 182 cm-1、1 121 cm-1、986 cm-1、945 cm-1、921 cm-1、839 cm-1、815 cm-1波數(shù)處均有尖銳吸收峰，葉相比根和莖于1 121 cm-1C-O的伸縮振動有較尖銳吸收峰.數(shù)據(jù)表明，箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿藥材樣品的根、莖及葉所含化合物種類基本相同，但苷類、糖類物質有所差別.

3 討 論

本研究分別對10批箭葉淫羊藿與柔毛淫羊藿藥材的根、莖及葉提取物進行了掃描，建立了相應的UV及IR對照指紋圖譜.并使用數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關“pearson”分析計算了淫羊藿藥材的根、莖及葉對照指紋圖譜之間的相似度.研究結果表明，箭葉淫羊藿和柔毛淫羊藿的根、莖及葉的UV及IR對照指紋圖譜相互之間的相似度大部分均高于0.90，只有柔毛淫羊藿的葉與莖的IR對照指紋圖譜相似度最低，但也高達0.873.此說明，淫羊藿根、莖及葉的70%乙醇提取液中所含化學物質種類基本相同，相關研究表明，不同藥用部位某些成分含量有差異，在其加工成飲片后，根、莖與葉質量、體積的差異導致藥材容易分層，造成取樣不均，從而不利于臨床應用及其藥效的發(fā)揮[7-8].本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿藥材的藥用部位以葉為最好，同時，還可以將淫羊藿全株進行提取，濃縮，干燥，加輔料做成淫羊藿配方顆粒，再對其含量進行標定，此方法既可解決因其不同部位含量差異造成的臨床藥用量問題，也可以對原藥材進行充分利用，以解決當前中藥材原料藥短缺的難題.