基于正相高效液相色譜法的S-奧拉西坦在比格犬體內(nèi)藥代動力學研究

孫文霞， 楊 晨， 榮祖元， 葉 雷， 賀 英， 程 強

(1.成都大學 四川抗菌素工業(yè)研究所 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室， 四川 成都 610052；2.四川省食品藥品檢驗檢測院， 四川 成都 611731； 3.重慶東澤醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司， 重慶 400042)

0 引 言

奧拉西坦(Oxiracetam，ORT)，化學名為4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，能夠促進磷酰膽堿和磷酰乙醇胺的合成和腦代謝，并能通過血腦屏障對特異性中樞神經(jīng)道路起刺激作用，從而改善智力和記憶[1].從ORT的結(jié)構(gòu)式(圖1)可見，其在吡咯環(huán)上引入了一個羥基，形成一個手性中心，因而存在光學對映體，即S-奧拉西坦(S-ORT)和R-奧拉西坦(R-ORT).相關(guān)文獻表明，S-ORT對改善動物的學習記憶能力以及認知功能障礙的效果優(yōu)于ORT.目前，已有學者報道了ORT異構(gòu)體的分離測定方法以及S-ORT靜脈注射后在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化情況[2-3].對此，本研究建立了正相高效液相色譜法(NP-HPLC)同時測定2種異構(gòu)體的濃度，并對S-ORT口服給藥后的藥代動力學等相關(guān)情況進行了分析.

圖1奧拉西坦的結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：S-ORT對照品(批號，091204-R，含量為100.4%)、R-ORT對照品(批號，20160121，含量為99.86%)，購自成都百途醫(yī)藥科技有限公司；吡拉西坦(批號，100386-200702)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、正己烷均為色譜純，購自美國Fisher公司；無水乙醇為色譜純(含量為99.8%)，購自北京百靈威科技有限公司.

實驗所用動物包括：比格犬18只，雌雄各半，7～8月齡，體重6～8 kg，四川養(yǎng)麝研究所比格犬繁育中心提供(動物許可證號，SCXK(川)2014-01).實驗前，動物檢疫和馴化飼養(yǎng)4周.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Sartorius CPA225D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)；TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；XW-80A型渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)；ZLS-1型真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 色譜條件.

實驗的色譜條件為：色譜柱為Daicel CHIRALPAK ID手性分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為正己烷∶乙醇(80∶20)；檢測波長為214 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣體積為20 μL.

2.1.2 溶液的制備.

分別精密稱取S-ORT和R-ORT對照品適量，用50%甲醇配制成含S-ORT和R-ORT均為4 mg/mL的混合對照品儲備液，4 ℃下保存，臨用時用50%甲醇配制成含R-ORT和S-ORT各為2.00、1.00、0.40、0.20、0.10、0.04、0.02 mg/mL的系列工作對照品溶液.

取內(nèi)標對照品適量，精密稱定，用50%甲醇配成終濃度為1.25 mg/mL的儲備液，4 ℃下保存待用.

2.1.3 血漿樣品前處理.

取血漿樣品200 μL，置1.5 mL具塞離心管中，加入50%甲醇20 μL，內(nèi)標溶液10 μL，振蕩混勻30 s，加入600 μL 甲醇，漩渦振蕩1 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液600 μL，置真空離心濃縮儀中50 ℃揮干，殘渣用200 μL甲醇復溶，過濾，吸取20 μL進樣分析.

2.2 方法驗證

2.2.1 專屬性.

按“2.1”項下方法，分別測定犬空白血漿、犬空白血漿加S-ORT與R-ORT以及內(nèi)標對照品、犬口服S-ORT后的血漿樣品，其色譜圖見圖2.結(jié)果表明，S-ORT、R-ORT和內(nèi)標的保留時間分別為14.9、10.7和12.9 min，犬血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾3者的測定.

2.2.2 標準曲線及定量限.

取犬空白血漿200 μL，加入ORT對照品系列工作溶液20 μL，配制成相當于S-ORT和R-ORT終濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的模擬血漿樣品，不加入50%甲醇，其他步驟按“2.1”項下方法.以待測物S-ORT或R-ORT的濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，經(jīng)加權(quán)(W=1/C)最小二乘法進行回歸運算，R-ORT和S-ORT的回歸方程分別為，Y=-0.015+0.018C，R=0.995和Y=-0.022+0.018C，R=0.996.

圖2 S-ORT、R-ORT和內(nèi)標的HPLC色譜圖

結(jié)果表明，兩者的線性范圍均為2.0～400.0 μg/mL，最低定量限均為2 μg/mL.

2.2.3 精密度與準確度.

取犬空白血漿200 μL，按“2.2.2"項下方法，制成含R-ORT和S-ORT濃度分別為4.0、40.0、200.0 μg/mL 3個濃度的質(zhì)控(QC)樣品，每一濃度做平行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，并根據(jù)每批隨行標準曲線，計算QC樣品中R-ORT和S-ORT的濃度，同時計算批內(nèi)、批間精密度和準確度，結(jié)果見表1.結(jié)果表明，R-ORT與S-ORT血漿樣品的批內(nèi)、批間精密度(RSD)均小于15%，方法符合生物樣品測定要求.

表1 S-ORT和R-ORT在血漿中的精密度和準確度(n=6)

2.2.4 穩(wěn)定性.

取犬空白血漿200 μL，按“2.2.2"項下方法，制成含R-ORT和S-ORT濃度分別為4.0，40.0，200.0 μg/mL 3個濃度的QC樣品，每一濃度配制3份.分別考察-80 ℃反復凍融3次、室溫下放置8 h、-80 ℃下冷凍15 d以及處理后的樣品在進樣池(5 ℃)中放置24 h后的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，3次凍融的回收率為90.14%～107.25%，在室溫放置8 h的回收率為91.96%～110.32%，-80 ℃下儲存15 d的回收率為90.37%～113.28%，處理后的樣品在進樣池中(5 ℃)放置24 h的回收率為95.41%～107.83%，RSD小于10.15%.結(jié)果表明，方法穩(wěn)定性良好.

2.3 藥代動力學研究

2.3.1 給藥及樣品采集.

取18只比格犬，隨機分為3個劑量組，每組6只，雌雄各半.S-ORT單次灌胃給藥，劑量分別為50 mg/kg、150 mg/kg、450 mg/kg，給藥前禁食12 h，給藥后禁食4 h，自由飲水.自下肢小隱靜脈采集給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24 h血樣2.5 mL，置肝素化EP管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-80 ℃保存，待測.

2.3.2 藥代動力學數(shù)據(jù)處理.

按“2.1.3"項下方法同時測定各時間點樣品中R-ORT和S-ORT的濃度.運用DAS 2.1軟件(中國藥理學會)計算2者的主要藥代動力學參數(shù).結(jié)果顯示，高、中、低3個劑量組的各個時間點血漿樣品中均未檢測出R-ORT.此說明，S-ORT經(jīng)口給藥后在犬體內(nèi)未發(fā)生明顯的手性轉(zhuǎn)化.低、中、高3種劑量S-ORT灌胃給藥后，其在比格犬體內(nèi)的平均血藥濃度隨時間變化過程符合一室模型.

S-ORT的血藥濃度—時間曲線如圖3所示，其主要藥動學參數(shù)包括，達峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、表面分布容積(V)、消除率(Cl)以及平均血藥濃度—時間曲線下面積(AUC(0～24 h))，見表2.

圖3 S-ORT在犬體內(nèi)的平均血藥濃度—時間曲線(n=6)

表2 犬口服S-ORT后的藥代動力學參數(shù)

3 討論與結(jié)論

目前，檢測ORT的方法有液質(zhì)聯(lián)用法[4-7]和HPLC法[8-9]等，而對ORT異構(gòu)體進行拆分需采用手性分析柱，并以正己烷、異丙醇及乙醇正相系統(tǒng)等為流動相.若采用液質(zhì)聯(lián)用法，由于流動相中沒有可以提供質(zhì)子的化合物或者基團，因而不能采用液質(zhì)聯(lián)用電噴霧質(zhì)譜法(HPLC-ESI-MS)，換用大氣壓力化學電離源(APCI)則要采用電暈針輔助電離，流動相全是有機相，有著火的危險，因而液質(zhì)聯(lián)用法不可行.

在文獻[10]中，其采用正己烷∶乙醇∶三氟乙酸(78∶22∶0.1)為流動相，本研究對正己烷、乙醇以及三氟乙酸的比例進行了考察，發(fā)現(xiàn)在不加入三氟乙酸，采用正己烷與乙醇的比例為80∶20時，ORT異構(gòu)體與內(nèi)標之間的分離度符合要求，且峰形良好.另外，采用甲醇按3∶1的比例處理血漿樣品，沉淀后的上清液含有一定比例的水，不能直接進樣分析，否則會破壞正相系統(tǒng)，不能正常出峰.因而需要采用氮氣吹干用甲醇或流動相復溶后，再進樣分析，同時這種方法還可以提高測試靈敏度.

本研究表明，S-ORT口服給藥后，低、中、高3個劑量的Tmax分別為1.62±1.15、1.31±0.63、1.80±0.51 h，不隨劑量變化；Cmax分別為48.63±14.13、99.57±38.25、184.62±47.63 μg/mL，AUC0-t分別為129.74±42.26、378.13±131.08、872.60±175.321 μg·h/mL，說明Cmax和AUC0-t隨劑量增加而增加，呈線性相關(guān)性.在各個時間點均未檢測到R-ORT，說明S-ORT口服給藥后，在犬體內(nèi)無明顯的變旋現(xiàn)象，與人體注射給藥的結(jié)果一致.