全身放射治療對宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子及其配體的影響

龔 星 田 添 梁素美*

放射治療是臨床治療惡性腫瘤的主要手段，但會引起脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的破壞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常以及影響機(jī)體免疫功能，腫瘤通過異?？乖瓕崿F(xiàn)免疫逃逸，因此改變腫瘤免疫應(yīng)答對治療腫瘤起著重要作用[1]。

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫中都發(fā)揮著重要作用，T細(xì)胞可分化為不同功能的T細(xì)胞，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)參與腫瘤的免疫逃逸和遷移、侵襲[2]。Th2細(xì)胞分泌白介素10(interleukin-10，IL-10)等細(xì)胞因子，起到免疫抑制的作用[3]。

近年來的研究顯示，T細(xì)胞的活化和分化受到可誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子(inducible costimulator，ICOS)及其配體(inducible costimulator ligand，ICOSL)的調(diào)節(jié)，電離輻射會影響ICOS及ICOSL的表達(dá)水平，但關(guān)于放射治療對免疫細(xì)胞以及ICOS和ICOSL的研究極少[4]。為此，本研究主要探究全身放射治療對宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞ICOS/ICOSL的影響，為臨床更好的利用放射治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

選用4～5周齡的所有BALB/c無胸腺裸鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實驗動物中心)，平均體質(zhì)量為(20±2)g。實驗瘤株子宮頸未分化鱗癌細(xì)胞系U14(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所)；所有引物均獲自Genewiz中國江蘇蘇州公司。

1.2 儀器與試劑

采用XHA600C型醫(yī)用電子直線加速器6 MV X射線(山東新華醫(yī)療)，Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo Scientific公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickerson公司)。Becton-Dickinson試劑盒(美國Becton-Dickinson公司)；ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑(上海榕柏生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，D6110A)；流式細(xì)胞術(shù)試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Bio-Rad實驗室)。

1.3 建模及放射治療方法

采用數(shù)表法將45只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和放療組，每組15只。將U14細(xì)胞分離并在新鮮培養(yǎng)基中再生長1 d。模型組和放療組小鼠皮下注射(1.0鼠皮下6個)U14細(xì)胞，在第4 d左右瘤體可生長至1 cm3左右，并通過病理學(xué)檢查確定為宮頸未分化鱗癌。對照組皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液，不進(jìn)行治療。在第4 d放療組小鼠接受全身放射治療，每日照射劑量為700 cGy，劑量率為50 cGy/min，每日1次。建模后每2 d用卡尺測量小鼠皮下腫瘤體積，測量腫瘤垂直直徑(長、寬，L＞W(wǎng))，腫瘤體積(V)計算為公式1：

在建模后12 d脫頸處死，取小鼠的胸腺、脾臟及腫瘤組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 免疫印跡檢測

使用蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)檢測小鼠胸腺(1/3個胸腺)中ICOS、ICOSL蛋白以及腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和MMP9的水平。Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品蛋白濃度，然后進(jìn)行12%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，對PVDF膜進(jìn)行免疫印跡檢測，并在室溫下用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉1 h。加入雙抗后室溫下孵育PVDF膜后脫色，加入電化學(xué)發(fā)光法檢測試劑，轉(zhuǎn)印膜上的電化學(xué)發(fā)光信號在X光膠片上感光，用IPWIN6.0軟件分析結(jié)果。

1.5 qRT-PCR檢測

使用[定量實時逆轉(zhuǎn)錄(quantitative real time，qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，qRT-PCR]檢測小鼠胸腺(1/3胸腺)中ICOS、ICOSL以及腫瘤組織中MMP2和MMP2及其mRNA的水平。組織研磨后使用RNA分離試劑盒分離RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄測定以合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃，反應(yīng)15 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活條件為85 ℃，反應(yīng)15 s；后進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗，通過在95 ℃下激活DNA聚合酶5 min進(jìn)行PCR，然后進(jìn)行40個循環(huán)的兩步PCR(95P、10 s和60 ℃、30 s)，最終延伸75 ℃、10 min，保持在4 ℃。使用2-ΔΔCT法分析mRNA表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺和脾臟(1/3胸腺+1/3脾臟)中Th1、Th2和Treg細(xì)胞含量。將1×106細(xì)胞加入PE-CD25抗體、FITC-CD4抗體、PE-Cy5-FOXP3以及相應(yīng)的對照Fc block、PE-Cy5-IgG2a，在4℃下避光孵育15～30 min，通過使用流式細(xì)胞儀立即分析染色的細(xì)胞。使用CellQuest軟件分析，根據(jù)檢測的CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞的數(shù)量計算Treg細(xì)胞的百分比。

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1、Th2細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)將2×105個細(xì)胞加入流式管，分別使用CD3-PE Cy5、CD8-PE Cy7抗體各 4 μl細(xì)標(biāo)記，避光孵育15 min，再使用IFN-γ-FITC、IL-4-PE標(biāo)記，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，后使用流式細(xì)胞儀檢測，CD3+CD4+IFN-γ+為Th1細(xì)胞，CD3+CD4+IL-4+為Th2細(xì)胞，記錄Th1、Th2細(xì)胞百分比。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS19.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。統(tǒng)計分析，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和獨(dú)立樣本t檢驗(groupt-test)，評估各組之間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積比較

在建模后第4 d，模型組和放療組小鼠的腫瘤體積達(dá)到1 cm3左右，隨即放療組開始放射治療。模型組小鼠的腫瘤體積隨著建模時間的延長顯著升高，在建模后第6 d、8 d、10 d和12 d，放療組小鼠的腫瘤體積顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.405，P=0.000)，見表1和圖1。

圖1 小鼠腫瘤體積變化情況

2.2 三組MMP2和MMP9比較

模型組的MMP2蛋白和MMP9蛋白水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.461，F(xiàn)=0.393，P=0.000)；放療組的MMP2和MMP9mRNA的水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.590，F(xiàn)=0.601；P=0.000)，見表2。

2.3 三組免疫細(xì)胞比較

模型組的Th1細(xì)胞比例顯著降低，而Treg和Th2細(xì)胞比例顯著升高，放療組的Th1細(xì)胞比例顯著高于模型組，而Treg和Th2細(xì)胞比例顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.427，F(xiàn)=3.349，F(xiàn)=9.951；P=0.000)，見表3。

2.4 三組ICOS/ICOSL水平比較

模型組的ICOS蛋白和ICOSL蛋白的水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.837，F(xiàn)=3.576；P=0.000)；放療組的ICOS、ICOSLmRNA的水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.793，F(xiàn)=3.750；P=0.000)，見表4。

表1 模型組與放療組小鼠腫瘤體積比較(cm3，±s)

表1 模型組與放療組小鼠腫瘤體積比較(cm3，±s)

注：由于對照組腫瘤體積都為0，模型組和其對比是為了表明建模成功，故此表只統(tǒng)計模型組和放療組

組別 只數(shù) 第4 d 第6 d 第8 d 第10 d 第12 d模型組 15 1.09±0.223.01±0.423.41±0.644.21±0.785.21±0.99放療組 15 1.01±0.211.88±0.352.21±0.481.76±0.301.51±0.28 F值 0.348 1.420 1.060 9.428 10.240 P值 0.169 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 三組MMP2和MMP9比較(±s)

表2 三組MMP2和MMP9比較(±s)

注：表中*為與對照組比較，P＜0.05；**為與對照組比較，P＜0.001；#為與模型組比較，P＜0.05；##為與模型組比較，P＜0.001

組別 只數(shù) MMP2蛋白 MMP2mRNA MMP9蛋白 MMP9mRNA對照組 15 1.04±0.30 0.84±0.33 0.87±0.30 0.93±0.26模型組 15 4.43±0.91** 4.27±0.87** 5.02±1.02** 5.15±0.97**放療組 15 2.09±0.66**## 2.13±0.69**## 2.28±0.79**## 2.46±0.86**##F值 312.974 289.432 327.236 435.885 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 三組免疫細(xì)胞比較(%)

表4 三組ICOS/ICOSL水平比較(±s)

表4 三組ICOS/ICOSL水平比較(±s)

注：表中*為與對照組比較，P＜0.05；**為與對照組比較，P＜0.001；#為與模型組比較，P＜0.05；##為與模型組比較，P＜0.001

組別 只數(shù) ICOS蛋白 ICOS mRNA ICOSL 蛋白 ICOSL mRNA對照組 15 0.81±0.18 0.95±0.21 0.87±0.15 0.94±0.13模型組 15 4.05±0.81** 3.56±0.75** 5.78±1.05** 6.04±1.02**放療組 15 1.79±0.56**## 2.03±0.47**## 3.19±0.58**## 3.42±0.56**##F值 670.849 368.466 643.846 600.542 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科腫瘤，據(jù)報道，世界每年有近500，000例新發(fā)宮頸癌病例，是女性第三大常見癌癥，可分為鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種類型，而宮頸癌的轉(zhuǎn)移是臨床治療的難點[5]。早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌通?？芍斡嵌鄶?shù)患者在診斷時出現(xiàn)局部晚期宮頸癌，其中III期和IVa期宮頸癌患者的5年生存率分別為40%和15%[6]?；陧樸K的放射治療(combination radiotherapy，CRT)被認(rèn)為是局部晚期宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而近年來以放射治療為主的綜合治療越來越受到關(guān)注，使放射治療抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及放射治療解除腫瘤免疫逃逸的機(jī)制備受重視。本研究使用U14細(xì)胞荷瘤裸鼠作為模型進(jìn)行全身放射治療，其結(jié)果顯示，在建模后第4 d模型組和放療組的腫瘤體積達(dá)到1 cm3左右，并開始接受全身放射治療，模型組小鼠的腫瘤體積隨著建模時間的延長顯著升高，在建模后第6 d、8 d、10 d和12 d，放療組的腫瘤體積顯著低于模型組，表明全身放射治療可顯著的抑制腫瘤的生長。

腫瘤的遷移和侵襲與許多酶的過度表達(dá)有關(guān)，MMP2、MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要組成部分，可以水解細(xì)胞間基質(zhì)蛋白，使細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移能力[7-8]。本研究結(jié)果顯示，模型組的MMP2和MMP9水平顯著高于對照組，放療組的MMP2和MMP9蛋白和mRNA的水平顯著低于放療組。Ager等[9]研究顯示，抑制MMP的表達(dá)可以提高放射治療的治療效果，提示全身放射治療可在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移與腫瘤的微環(huán)境改變、血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及免疫反應(yīng)等有關(guān)。Th2細(xì)胞會通過分泌IL-4、IL-10等因子發(fā)揮免疫抑制作用并促進(jìn)細(xì)胞生長[10]。Treg水平的升高會抑制免疫，并影響細(xì)胞功能參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組的Th1細(xì)胞比例顯著降低，而Treg和Th2細(xì)胞比例顯著升高，放療組的Th1細(xì)胞比例顯著高于模型組，而Treg和Th2細(xì)胞比例顯著低于模型組。Th1/Th2細(xì)胞處于動態(tài)平衡中，Th1和Th2分別參與促炎和免疫抑制的作用[12]。Th1細(xì)胞占主要優(yōu)勢時機(jī)體處于抗腫瘤狀態(tài)，而Th2細(xì)胞過高時則出現(xiàn)免疫逃逸。過往研究顯示，卵巢癌患者Th1/Th2平衡向Th2漂移，而Treg具有促進(jìn)Th1/Th2平衡向Th2漂移的作用[13-14]。

為進(jìn)一步的探究放射治療影響免疫細(xì)胞的機(jī)制，本研究分析了ICOS/ICOSL的表達(dá)水平，其結(jié)果顯示，模型組的ICOS和ICOSL的水平顯著高于對照組，放療組的ICOS和ICOSL蛋白和mRNA的水平顯著低于模型組。ICOS/ICOSL表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的表面，影響Treg細(xì)胞表達(dá)和促進(jìn)Th2活化，使腫瘤逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)，Zheng等[15]研究顯示，ICOS/ICOSL可通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞提高B淋巴瘤細(xì)胞對ABT-199的敏感性；Kieusuong等[16]研究表明，Treg的產(chǎn)生與ICOS/ICOSL的結(jié)合有關(guān)，靶向ICOS/ICOSL途徑調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞可能是一種有前景的治療濾泡性淋巴瘤免疫療法。

全身放射治療可有效的抑制宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤組織的生長，放射治療一方面通過下調(diào)MMP2和MMP9表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞遷移，另一方面通過抑制ICOS和ICOSL的表達(dá)水平下調(diào)Treg細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例，從而解除免疫逃逸起到抑瘤作用。