芪藶強心膠囊中酚酸類成分在大鼠體內(nèi)藥動學研究*

張 瑜，張富賡，朱明丹，張少強，杜武勛，肖學鳳

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300350；3.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

近年來，慢性心力衰竭的發(fā)病率呈上升趨勢，成為心血管疾病患者的主要死亡原因之一[1]。芪藶強心膠囊首次收載于2015版《中國藥典》中，具有益氣溫陽，活血通絡，利水消腫的功效。多中心臨床試驗研究顯示芪藶強心膠囊聯(lián)合西藥能夠提高慢性心力衰竭患者的運動耐力和生活質(zhì)量，降低心血管事件和再住院率[2-3]。丹參為方中臣藥，配伍人參、葶藶子，具有通經(jīng)活血利水的功效。其中丹參的酚酸類化合物是心臟保護作用的主要活性物質(zhì)，具有保護心肌缺血再灌注損傷、保護血管內(nèi)皮細胞、抗血栓及抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性[4]，作用機制涉及改善心肌能量代謝、抑制炎癥反應和氧化應激、提高心肌細胞活力、抑制凋亡等[5-8]。因此，本實驗建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的方法測定芪藶強心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸）的血藥濃度，并研究上述活性成分在大鼠體內(nèi)的藥動學特征，為進一步明確芪藶強心膠囊的藥效物質(zhì)基礎提供實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

HPLC-MS/MS質(zhì)譜儀：采用API 4000 trap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，SER.N：AR26221101（美國應用生物系統(tǒng)公司，裝備島津LC-20 AD泵、SIL-20 AC恒溫自動進樣器、CBM-20 A控制器、CTO-20 A柱溫箱、AnalystSoftware色譜工作站（1.5.2版本）），XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Sorvall RC6+型離心機（美國Thermoscientific公司），MIKRO 220R型低溫高速離心機（德國Hettich公司），Targin VX-02多管蝸旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

芪藶強心膠囊（丹酚酸A0.772mg/g，丹酚酸B 3.987mg/g，丹參素 1.770mg/g，紫草酸 0.337mg/g，迷迭香酸0.354mg/g，原兒茶酸0.050mg/g）[9]購自石家莊以嶺藥業(yè)（批號140805）；標準品丹酚酸B（批號111562-201515，質(zhì)量分數(shù)96.2%），丹參素（批號110855-201614，質(zhì)量分數(shù)98.1%），迷迭香酸（批號111871-201505，質(zhì)量分數(shù)98.5%），原兒茶酸（批號110809-201205，質(zhì)量分數(shù)99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸A（批號H1315006，質(zhì)量分數(shù)≥98%），紫草酸（批號H1624050，質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；水為超純水，乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

SPF級健康雄性SD大鼠（200～240 g）由解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK（軍）2012-0004，在天津中醫(yī)藥大學的動物房內(nèi)飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本課題經(jīng)過天津中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批準號：TCMCAEC2015023）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 Agilent ZOBRAX XDB-C18（4.6mm×50mm，3.5μm），柱溫 40℃，流動相 0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脫（0.01～0.6min，7%B；0.6～0.8min，7%～15%B；0.8～7.8 min，15%～65%B；7.8～8.8 min，65%～100%B；8.8～9.8min，100%B；9.8～9.81min，100%～7%B；9.81～12min，7%B），流速0.45mL/min，進樣量10μL。

電噴霧離子源（ESI），負離子模式檢測，多反映監(jiān)測（MRM）掃描方式，噴霧電壓-4 200 V，脫溶液溫度600℃，氣簾氣20 L/min，霧化氣65 L/min，加熱輔助氣55 L/min。6種酚酸類成分質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 溶液的配制

表1 6種酚酸類成分和內(nèi)標（IS）的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 M ainmass parametersof six phenolic acidsand internalstandard

2.2.1 標準品溶液 精密稱取丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸標準品適量，分別加二甲基亞砜（DMSO）溶解并稀釋成2mg/mL的儲備液。分別精密吸取上述儲備液適量，混合并用甲醇∶水（1∶1）溶液進行逐級稀釋，得到混合標準品系列溶液質(zhì)量濃度如下：丹酚酸A、原兒茶酸（5、10、25、100、250、1 000、2 500、5 000、1×104ng/mL）；丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸（10、20、50、200、500、2 000、5 000、1×104、2×104ng/mL）；丹參素（50、100、250、500、1 000、2 500、1×104、2.5×104、1×105ng/mL），上述儲備液和標準系列溶液均置于4℃儲存。

2.2.2 內(nèi)標溶液 精密稱取氯霉素標準品適量，加甲醇∶乙腈（1∶1）溶解搖勻，配制成濃度 100 ng/mL 的內(nèi)標溶液（IS），置于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理 取大鼠血漿樣品50μL，依次加入5μL標準溶液（50%甲醇水）、10μL維生素C（1.4 mg/mL-100%H2O）和 150μL IS溶液，渦旋30 s，離心 10min（4 ℃ 15 000 r/min），取上清液 10μL進樣分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿（等體積甲醇代替內(nèi)標溶液）、空白血漿+標準品（丹酚酸A、原兒茶酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為1ng/mL，丹參素血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為5 ng/mL）及灌胃給予芪藶強心膠囊混懸液后20min的大鼠血漿樣品，按2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析，得到空白血漿、空白血漿+標準品和給藥后血漿樣品的色譜圖，結果見圖1。結果表明：丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸及IS的保留時間分別為7.42、7.59、4.97、7.41、7.45、6.78 及 8.23min，各酚酸類成分和IS能夠完全分離，不會受到大鼠血漿樣品中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，方法專屬性良好。

2.4.2 線性關系考察 取大鼠空白血漿50μL，加入混合標準品系列溶液，得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、10、25、100、250、500、1 000 ng/mL 的丹酚酸 A和原兒茶酸血漿樣品溶液；1、2、5、20、50、200、500、1 000、2 000 ng/mL的丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液；5、10、25、50、100、250、1 000、2 500、1×104ng/mL的丹參素血漿樣品溶液。根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析。以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），標準品與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，結果見表2。

2.4.3 精密度與準確度考察 取大鼠空白血漿，加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合標準品溶液，得到丹酚酸 A（1、25、800 ng/mL），丹酚酸 B（2、50、1 600 ng/mL），丹參素（10、250、8 000 ng/mL），紫草酸（2、50、1 600 ng/mL），迷迭香酸（2、50、1 600 ng/mL）及原兒茶酸（1、25、800 ng/mL）低、中、高3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（QC），根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析。于同日內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度，并測定均值與真實值的相對誤差，計算準確度。精密度以相對標準偏差（RSD）表示，準確度以相對誤差（RE）表示，結果見表3。在上述3個質(zhì)量濃度下，各成分日內(nèi)和日間精密度的RSD均＜15%，且準確度的RE在±15%之間，符合生物樣品測定的要求。

圖1 空白血漿（1）、空白血漿+標準品（2）和灌胃1.3g/kg芪藶強心膠囊后20m in的含藥血漿（3）的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of blank p lasma（1），blank p lasma+reference substances（2），and plasma samples after oraladm inistration of1.3 g/kg QiliQiangxin Capsule at20m in（3）

表2 6種酚酸類成分的線性方程、相關系數(shù)（r）、線性范圍和定量下線（LLOQ）Tab.2 Regression equation，correlation coefficient（r），linearity range and LLOQ of six phenolic acids

2.4.4 基質(zhì)效應與回收率考察 取上述低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC樣品，根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析，記錄成分峰面積（A）；另取甲醇水溶液代替空白血漿，其余操作如上，得到成分峰面積（B）；另取大鼠空白血漿，根據(jù)2.3項處理血漿樣品后加入QC樣品，進樣分析，記錄成分峰面積（C），A和B的比值為基質(zhì)效應，A和C的比值為回收率，結果見表3。各成分和IS的基質(zhì)效應的范圍在80.5%～104%，回收率的范圍在81.0%～103%。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取上述低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC樣品，各6份，考察樣品在自動進樣器中放置24 h（樣品處理后穩(wěn)定性），室溫放置24 h（短期穩(wěn)定性），在-20℃條件下凍融3次（凍融穩(wěn)定性）及在-80℃條件下放置30 d（長期穩(wěn)定性）的穩(wěn)定性，結果見表4。血漿中6種酚酸類成分穩(wěn)定性的RSD均＜15%，說明樣品在上述條件下放置均穩(wěn)定。

2.5 藥動學研究 取6只雄性SD大鼠，實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。灌胃給予芪藶強心膠囊混懸液（0.5%CMC-Na配制成混懸液），給藥劑量1.3 g/kg，于給藥后 0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 經(jīng)目內(nèi)眥靜脈叢取血 0.5mL，置于肝素鈉抗凝管中，在12 000 r/min的條件下離心10min，分離血漿，置于-20℃的冰箱中保存待測，測定前根據(jù)2.3項處理血漿樣品。大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中6種酚酸類成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸）的藥時曲線如圖2。采用DAS 3.0軟件非房室模型計算藥動學參數(shù)，結果見表5。

表3 血漿樣品中6種酚酸類成分的精密度、準確度、基質(zhì)效應和回收率（n=6）Tab.3 Precision，accuracy，matrix effectand recovery of six phenolic acids in plasma sam ples（n=6）

3 討論

本實驗建立HPLC-MS/MS方法同時測定大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中丹參的6種酚酸類活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸）的血藥濃度，經(jīng)方法學考察符合生物樣品測定的要求，可用于生物體內(nèi)的藥動學研究。實驗初期對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，根據(jù)文獻報道[10-11]酚酸類成分在負離子模式下響應良好，本實驗對正、負離子兩種掃描方式下待測物的響應強度進行了比較，結果顯示在負離子模式下靈敏度更高，可以獲得穩(wěn)定的[M-H]-，因此選用負離子模式對待測物進行檢測。在對色譜條件優(yōu)化時，酚酸類成分檢測的流動相多為加入酸的水-乙腈系統(tǒng)[12]，因此實驗選擇0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）為流動相，結果顯示各待測物分離效果最佳，色譜峰峰形較好。

表4 血漿樣品中6種酚酸類成分的穩(wěn)定性（n=6）Tab.4 Stability of six phenolic acids in plasma samples under differentstorage conditions（n=6）

表5 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后6種酚酸類成分的藥動學參數(shù)（n=6）Tab.5 PK parametersof six phenolic acidsafter oral adm inistration ofQiliQiangxin Capsule（n=6）

圖2 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中6種酚酸類成分的藥時曲線（n=6）Fig.2 M ean concentration-time profilesof six phenolic acidsafter oraladm inistration of QiliQiangxin Capsule（n=6）

本實驗大鼠體內(nèi)丹酚酸A，丹酚酸B，丹參素，紫草酸，迷迭香酸，原兒茶酸均存在明顯的雙峰現(xiàn)象，表明芪藶強心膠囊中上述酚酸類成分在體內(nèi)可能通過肝腸循環(huán)進行重吸收。據(jù)文獻報道大鼠灌胃丹參提取物后，酚酸類成分吸收表現(xiàn)為單峰[13-14]或雙峰[15-16]，而復方中藥芪藶強心膠囊成分復雜，且酚酸類成分存在同系物轉化，丹酚酸B可通過水解掉一分子丹參素成為紫草酸，再脫羧轉化成丹酚酸A，而丹酚酸A可進一步降解成為丹酚酸C和異丹酚酸C[17]，另在生物體內(nèi)大分子的丹酚酸A、丹酚酸B和迷迭香酸可轉化成小分子丹參素[18]，因此本實驗藥時曲線呈現(xiàn)雙峰吸收現(xiàn)象。藥動學結果顯示：大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中6種酚酸類成分的達峰時間（Tmax）在10～40min內(nèi)，半衰期（t1/2）在3.34～8.38 h，呈現(xiàn)吸收快、消除亦快的特點。藥動學參數(shù)血藥達峰濃度（Cmax）和血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞）能夠評價藥物的吸收程度和體內(nèi)暴露情況。大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中酚酸類活性成分的Cmax和AUC0-∞從大到小排序依次為丹酚酸B＞丹參素＞紫草酸＞迷迭香酸＞原兒茶酸＞丹酚酸A，其中丹酚酸B的Cmax（502 ng/mL）和AUC0-∞（980.47 h·ng/mL）最高，說明其吸收程度和體內(nèi)暴露情況優(yōu)于方中其他活性成分。既往研究報道丹酚酸B經(jīng)大鼠口服后能夠迅速吸收并轉化成丹參素，因此丹參素在受試者體內(nèi)具有較高的系統(tǒng)暴露水平[19-21]。但本研究中表明大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中丹酚酸B的系統(tǒng)暴露水平明顯高于其它成分，原因可能與芪藶強心膠囊中丹酚酸B的含量（3.987mg/g）較高有關[9]。另一方面，丹酚酸B對心肌梗死具有保護作用，并能夠明顯改善心肌缺血再灌注損傷，對心血管系統(tǒng)具有顯著的保護作用[22]。另外，課題組前期對芪藶強心膠囊含量測定結果顯示酚酸類成分的含量從大到小排序依次為[9]：丹酚酸B＞丹參素＞丹酚酸A＞迷迭香酸＞紫草酸＞原兒茶酸，而本研究中丹酚酸A的Cmax（8.96 ng/mL）和AUC0-∞（21.40 h·ng/mL）最低，其原因可能為丹酚酸A在正常機體內(nèi)的吸收情況較差，或通過甲基化和葡萄糖醛酸化快速生成小分子代謝產(chǎn)物有關[23]。綜上，本實驗對芪藶強心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分的藥動學特征進行研究，闡述藥物的體內(nèi)過程，為進一步確定藥效物質(zhì)基礎提供實驗依據(jù)。