芪藶強心膠囊中酚酸類成分在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究*

張 瑜，張富賡，朱明丹，張少強，杜武勛，肖學(xué)鳳

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300350；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

近年來，慢性心力衰竭的發(fā)病率呈上升趨勢，成為心血管疾病患者的主要死亡原因之一[1]。芪藶強心膠囊首次收載于2015版《中國藥典》中，具有益氣溫陽，活血通絡(luò)，利水消腫的功效。多中心臨床試驗研究顯示芪藶強心膠囊聯(lián)合西藥能夠提高慢性心力衰竭患者的運動耐力和生活質(zhì)量，降低心血管事件和再住院率[2-3]。丹參為方中臣藥，配伍人參、葶藶子，具有通經(jīng)活血利水的功效。其中丹參的酚酸類化合物是心臟保護作用的主要活性物質(zhì)，具有保護心肌缺血再灌注損傷、保護血管內(nèi)皮細胞、抗血栓及抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性[4]，作用機制涉及改善心肌能量代謝、抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、提高心肌細胞活力、抑制凋亡等[5-8]。因此，本實驗建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的方法測定芪藶強心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸）的血藥濃度，并研究上述活性成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征，為進一步明確芪藶強心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

HPLC-MS/MS質(zhì)譜儀：采用API 4000 trap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，SER.N：AR26221101（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，裝備島津LC-20 AD泵、SIL-20 AC恒溫自動進樣器、CBM-20 A控制器、CTO-20 A柱溫箱、AnalystSoftware色譜工作站（1.5.2版本）），XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Sorvall RC6+型離心機（美國Thermoscientific公司），MIKRO 220R型低溫高速離心機（德國Hettich公司），Targin VX-02多管蝸旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

芪藶強心膠囊（丹酚酸A0.772mg/g，丹酚酸B 3.987mg/g，丹參素 1.770mg/g，紫草酸 0.337mg/g，迷迭香酸0.354mg/g，原兒茶酸0.050mg/g）[9]購自石家莊以嶺藥業(yè)（批號140805）；標準品丹酚酸B（批號111562-201515，質(zhì)量分數(shù)96.2%），丹參素（批號110855-201614，質(zhì)量分數(shù)98.1%），迷迭香酸（批號111871-201505，質(zhì)量分數(shù)98.5%），原兒茶酸（批號110809-201205，質(zhì)量分數(shù)99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸A（批號H1315006，質(zhì)量分數(shù)≥98%），紫草酸（批號H1624050，質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；水為超純水，乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

SPF級健康雄性SD大鼠（200～240 g）由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號SCXK（軍）2012-0004，在天津中醫(yī)藥大學(xué)的動物房內(nèi)飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本課題經(jīng)過天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準（批準號：TCMCAEC2015023）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 Agilent ZOBRAX XDB-C18（4.6mm×50mm，3.5μm），柱溫 40℃，流動相 0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脫（0.01～0.6min，7%B；0.6～0.8min，7%～15%B；0.8～7.8 min，15%～65%B；7.8～8.8 min，65%～100%B；8.8～9.8min，100%B；9.8～9.81min，100%～7%B；9.81～12min，7%B），流速0.45mL/min，進樣量10μL。

電噴霧離子源（ESI），負離子模式檢測，多反映監(jiān)測（MRM）掃描方式，噴霧電壓-4 200 V，脫溶液溫度600℃，氣簾氣20 L/min，霧化氣65 L/min，加熱輔助氣55 L/min。6種酚酸類成分質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 溶液的配制

表1 6種酚酸類成分和內(nèi)標（IS）的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 M ainmass parametersof six phenolic acidsand internalstandard

2.2.1 標準品溶液 精密稱取丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸標準品適量，分別加二甲基亞砜（DMSO）溶解并稀釋成2mg/mL的儲備液。分別精密吸取上述儲備液適量，混合并用甲醇∶水（1∶1）溶液進行逐級稀釋，得到混合標準品系列溶液質(zhì)量濃度如下：丹酚酸A、原兒茶酸（5、10、25、100、250、1 000、2 500、5 000、1×104ng/mL）；丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸（10、20、50、200、500、2 000、5 000、1×104、2×104ng/mL）；丹參素（50、100、250、500、1 000、2 500、1×104、2.5×104、1×105ng/mL），上述儲備液和標準系列溶液均置于4℃儲存。

2.2.2 內(nèi)標溶液 精密稱取氯霉素標準品適量，加甲醇∶乙腈（1∶1）溶解搖勻，配制成濃度 100 ng/mL 的內(nèi)標溶液（IS），置于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理 取大鼠血漿樣品50μL，依次加入5μL標準溶液（50%甲醇水）、10μL維生素C（1.4 mg/mL-100%H2O）和 150μL IS溶液，渦旋30 s，離心 10min（4 ℃ 15 000 r/min），取上清液 10μL進樣分析。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿（等體積甲醇代替內(nèi)標溶液）、空白血漿+標準品（丹酚酸A、原兒茶酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為1ng/mL，丹參素血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為5 ng/mL）及灌胃給予芪藶強心膠囊混懸液后20min的大鼠血漿樣品，按2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析，得到空白血漿、空白血漿+標準品和給藥后血漿樣品的色譜圖，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸及IS的保留時間分別為7.42、7.59、4.97、7.41、7.45、6.78 及 8.23min，各酚酸類成分和IS能夠完全分離，不會受到大鼠血漿樣品中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿50μL，加入混合標準品系列溶液，得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、10、25、100、250、500、1 000 ng/mL 的丹酚酸 A和原兒茶酸血漿樣品溶液；1、2、5、20、50、200、500、1 000、2 000 ng/mL的丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液；5、10、25、50、100、250、1 000、2 500、1×104ng/mL的丹參素血漿樣品溶液。根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析。以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），標準品與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y）進行線性回歸分析，結(jié)果見表2。

2.4.3 精密度與準確度考察 取大鼠空白血漿，加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合標準品溶液，得到丹酚酸 A（1、25、800 ng/mL），丹酚酸 B（2、50、1 600 ng/mL），丹參素（10、250、8 000 ng/mL），紫草酸（2、50、1 600 ng/mL），迷迭香酸（2、50、1 600 ng/mL）及原兒茶酸（1、25、800 ng/mL）低、中、高3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（QC），根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析。于同日內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度，并測定均值與真實值的相對誤差，計算準確度。精密度以相對標準偏差（RSD）表示，準確度以相對誤差（RE）表示，結(jié)果見表3。在上述3個質(zhì)量濃度下，各成分日內(nèi)和日間精密度的RSD均＜15%，且準確度的RE在±15%之間，符合生物樣品測定的要求。

圖1 空白血漿（1）、空白血漿+標準品（2）和灌胃1.3g/kg芪藶強心膠囊后20m in的含藥血漿（3）的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of blank p lasma（1），blank p lasma+reference substances（2），and plasma samples after oraladm inistration of1.3 g/kg QiliQiangxin Capsule at20m in（3）

表2 6種酚酸類成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、線性范圍和定量下線（LLOQ）Tab.2 Regression equation，correlation coefficient（r），linearity range and LLOQ of six phenolic acids

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)與回收率考察 取上述低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC樣品，根據(jù)2.3項處理血漿樣品，并按2.1項下條件進行HPLC-MS/MS分析，記錄成分峰面積（A）；另取甲醇水溶液代替空白血漿，其余操作如上，得到成分峰面積（B）；另取大鼠空白血漿，根據(jù)2.3項處理血漿樣品后加入QC樣品，進樣分析，記錄成分峰面積（C），A和B的比值為基質(zhì)效應(yīng)，A和C的比值為回收率，結(jié)果見表3。各成分和IS的基質(zhì)效應(yīng)的范圍在80.5%～104%，回收率的范圍在81.0%～103%。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取上述低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC樣品，各6份，考察樣品在自動進樣器中放置24 h（樣品處理后穩(wěn)定性），室溫放置24 h（短期穩(wěn)定性），在-20℃條件下凍融3次（凍融穩(wěn)定性）及在-80℃條件下放置30 d（長期穩(wěn)定性）的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。血漿中6種酚酸類成分穩(wěn)定性的RSD均＜15%，說明樣品在上述條件下放置均穩(wěn)定。

2.5 藥動學(xué)研究 取6只雄性SD大鼠，實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。灌胃給予芪藶強心膠囊混懸液（0.5%CMC-Na配制成混懸液），給藥劑量1.3 g/kg，于給藥后 0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 經(jīng)目內(nèi)眥靜脈叢取血 0.5mL，置于肝素鈉抗凝管中，在12 000 r/min的條件下離心10min，分離血漿，置于-20℃的冰箱中保存待測，測定前根據(jù)2.3項處理血漿樣品。大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中6種酚酸類成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸）的藥時曲線如圖2。采用DAS 3.0軟件非房室模型計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表5。

表3 血漿樣品中6種酚酸類成分的精密度、準確度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率（n=6）Tab.3 Precision，accuracy，matrix effectand recovery of six phenolic acids in plasma sam ples（n=6）

3 討論

本實驗建立HPLC-MS/MS方法同時測定大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中丹參的6種酚酸類活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸）的血藥濃度，經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品測定的要求，可用于生物體內(nèi)的藥動學(xué)研究。實驗初期對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，根據(jù)文獻報道[10-11]酚酸類成分在負離子模式下響應(yīng)良好，本實驗對正、負離子兩種掃描方式下待測物的響應(yīng)強度進行了比較，結(jié)果顯示在負離子模式下靈敏度更高，可以獲得穩(wěn)定的[M-H]-，因此選用負離子模式對待測物進行檢測。在對色譜條件優(yōu)化時，酚酸類成分檢測的流動相多為加入酸的水-乙腈系統(tǒng)[12]，因此實驗選擇0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）為流動相，結(jié)果顯示各待測物分離效果最佳，色譜峰峰形較好。

表4 血漿樣品中6種酚酸類成分的穩(wěn)定性（n=6）Tab.4 Stability of six phenolic acids in plasma samples under differentstorage conditions（n=6）

表5 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后6種酚酸類成分的藥動學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.5 PK parametersof six phenolic acidsafter oral adm inistration ofQiliQiangxin Capsule（n=6）

圖2 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中6種酚酸類成分的藥時曲線（n=6）Fig.2 M ean concentration-time profilesof six phenolic acidsafter oraladm inistration of QiliQiangxin Capsule（n=6）

本實驗大鼠體內(nèi)丹酚酸A，丹酚酸B，丹參素，紫草酸，迷迭香酸，原兒茶酸均存在明顯的雙峰現(xiàn)象，表明芪藶強心膠囊中上述酚酸類成分在體內(nèi)可能通過肝腸循環(huán)進行重吸收。據(jù)文獻報道大鼠灌胃丹參提取物后，酚酸類成分吸收表現(xiàn)為單峰[13-14]或雙峰[15-16]，而復(fù)方中藥芪藶強心膠囊成分復(fù)雜，且酚酸類成分存在同系物轉(zhuǎn)化，丹酚酸B可通過水解掉一分子丹參素成為紫草酸，再脫羧轉(zhuǎn)化成丹酚酸A，而丹酚酸A可進一步降解成為丹酚酸C和異丹酚酸C[17]，另在生物體內(nèi)大分子的丹酚酸A、丹酚酸B和迷迭香酸可轉(zhuǎn)化成小分子丹參素[18]，因此本實驗藥時曲線呈現(xiàn)雙峰吸收現(xiàn)象。藥動學(xué)結(jié)果顯示：大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中6種酚酸類成分的達峰時間（Tmax）在10～40min內(nèi)，半衰期（t1/2）在3.34～8.38 h，呈現(xiàn)吸收快、消除亦快的特點。藥動學(xué)參數(shù)血藥達峰濃度（Cmax）和血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞）能夠評價藥物的吸收程度和體內(nèi)暴露情況。大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中酚酸類活性成分的Cmax和AUC0-∞從大到小排序依次為丹酚酸B＞丹參素＞紫草酸＞迷迭香酸＞原兒茶酸＞丹酚酸A，其中丹酚酸B的Cmax（502 ng/mL）和AUC0-∞（980.47 h·ng/mL）最高，說明其吸收程度和體內(nèi)暴露情況優(yōu)于方中其他活性成分。既往研究報道丹酚酸B經(jīng)大鼠口服后能夠迅速吸收并轉(zhuǎn)化成丹參素，因此丹參素在受試者體內(nèi)具有較高的系統(tǒng)暴露水平[19-21]。但本研究中表明大鼠灌胃芪藶強心膠囊后，血漿中丹酚酸B的系統(tǒng)暴露水平明顯高于其它成分，原因可能與芪藶強心膠囊中丹酚酸B的含量（3.987mg/g）較高有關(guān)[9]。另一方面，丹酚酸B對心肌梗死具有保護作用，并能夠明顯改善心肌缺血再灌注損傷，對心血管系統(tǒng)具有顯著的保護作用[22]。另外，課題組前期對芪藶強心膠囊含量測定結(jié)果顯示酚酸類成分的含量從大到小排序依次為[9]：丹酚酸B＞丹參素＞丹酚酸A＞迷迭香酸＞紫草酸＞原兒茶酸，而本研究中丹酚酸A的Cmax（8.96 ng/mL）和AUC0-∞（21.40 h·ng/mL）最低，其原因可能為丹酚酸A在正常機體內(nèi)的吸收情況較差，或通過甲基化和葡萄糖醛酸化快速生成小分子代謝產(chǎn)物有關(guān)[23]。綜上，本實驗對芪藶強心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分的藥動學(xué)特征進行研究，闡述藥物的體內(nèi)過程，為進一步確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。