黃芪中黃芪甲苷含量測定研究進(jìn)展

張雪

摘要：在綜述國內(nèi)黃芪中黃芪甲苷含量測定方法基礎(chǔ)上，分析黃芪中的黃芪甲苷含量測定方法研究進(jìn)展，包括HPLC-ELSD法、HPLC/ESI-MS聯(lián)用法、HPLC-UV法、UPLC-MS法、HPLC-DAD-ELSD法等，旨在為進(jìn)一步開展黃芪相關(guān)研究提供理論借鑒。

關(guān)鍵詞：黃芪甲苷;含量測定;黃芪;HPLC-ELSD;HPLC/ESI-MS

中圖分類號：R284.2? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2019）04-0049-03

黃芪具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫和托瘡生肌等功效。目前，主要用黃芪皂苷中的黃芪甲苷（astraga bside IV）作為評價(jià)黃芪藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。在查閱收集大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，綜述黃芪甲苷的檢測方法研究進(jìn)展，為黃芪甲苷相關(guān)研究提供技術(shù)借鑒。

1 黃芪中黃芪甲苷含量測定方法

黃芪甲苷的檢測方法主要有HPLC-ELSD法、HPLC/ESI-MS聯(lián)用法、HPLC-UV法、UPLC-MS法、HPLC-DAD-ELSD法、近紅外光譜法等。

1.1 HPLC-ELSD法

蒸發(fā)光散射檢測器作為通用型檢測器，不依賴于化合物光學(xué)性質(zhì)，對非揮發(fā)組分均有較好的響應(yīng)，廣泛應(yīng)用于皂苷類、萜類、生物堿類、糖類等中藥成分的質(zhì)量控制。

崔雪瑩等探討蒸發(fā)光散射檢測器高效液相色譜法（HPLC-ELSD）測定黃芪中4種皂苷類活性成分含量的可行性。采用ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以水-乙腈為流動相梯度洗脫，流速0.8 mL/min，載氣流速1.2 L/min，漂移管溫度105 ℃。測定結(jié)果表明，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ的含量分別為4.40 ，0.2，1.42，1.31 mg/g，分別在0.476～5.712，0.139～8.340，0.434～6.944，0.392～4.704 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，精密度分別為2.25%，0.81%，2.52%，2.31%，平均回收率分別為101.84%，98.96%，103.27%，100.35%。

林宏琳等通過HPLC-SPD-ELSD串聯(lián)系統(tǒng)比較、樣品前處理及色譜條件優(yōu)化，測定保健食品中黃芪甲苷的量。以甲醇為提取溶劑對樣品進(jìn)行超聲提取，色譜柱選用Thermo Accucore XL C8（150 mm×4.6 mm，4 μm），流動相為乙腈-水（32∶68），柱溫35 ℃，體積流量1 mL/min，紫外檢測波長192 nm，進(jìn)樣量20 μl，漂移管溫度40 ℃，氮?dú)鈮毫?08 kPa。測定結(jié)果表明：黃芪甲苷在0.05～0.25 mg/ml范圍呈良好線性關(guān)系，ELSD和SPD分別為0.999 8和0.999 2;方法檢出限為0.02，0.04 mg/g;3批樣品黃芪甲苷平均含量分別為1.06，1.03，1.05 mg/g和1.11，1.06，1.09 mg/g，平均加樣回收率為96.80%，98.70%。該法便捷經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確可靠，可根據(jù)實(shí)際情況選擇ELSD或SPD檢測器，為保健食品中黃芪甲苷的質(zhì)量控制與評價(jià)及相關(guān)研究提供適用方法。

1.2 HPLC/ESI-MS聯(lián)用法

電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）是一種可得到每個(gè)色譜峰的紫外光譜圖、保留時(shí)間、相對分子質(zhì)量和特征碎片等信息的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，與質(zhì)譜聯(lián)用可彌補(bǔ)常規(guī)紫外檢測對某些紫外吸收弱的化合物不靈敏、提供分子結(jié)構(gòu)信息較少的缺點(diǎn)。

張文敬等利用高效液相色譜法制備黃芪水煎液中的黃芪甲苷，并通過質(zhì)譜對收集到的組分進(jìn)行鑒定。分析型色譜條件為：色譜柱EcliPseXDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱，乙腈-水梯度洗脫，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。制備型色譜條件為：Hypersil C18（20 mm×300 mm，10 μm）柱，流速10 mL/min，進(jìn)樣量2 mL，其他同分析型色譜。質(zhì)譜分析法為電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）源，電壓3.5 kV，正、負(fù)離子檢測，鞘氣（N2）流速80 a.u.，輔助氣（N2）流速15 a.u.，碰撞氣體為氦氣，毛細(xì)管溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓±5 V。全離子掃描范圍50～2 000 m/z。經(jīng)分析型色譜得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.1717 C+0.4657，r=0.999 6，在0.01～0.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。制備型色譜方法得到的峰型較好，峰間隔適當(dāng)，能夠?qū)⑾噜徑M分分離。收集保留時(shí)間為26 min的組分，經(jīng)分析型色譜和ESI-MSn鑒定為黃芪皂甙IV（astragaloside IV），即黃芪甲苷，且純度可達(dá)95%。

1.3 HPLC-UV法

高效液相色譜法是檢測藥材中成分含量的一種常用方法。紫外檢測器靈敏度高，噪間低，線性范圍寬，選擇性好，對環(huán)境溫度、流動相組成變化和流速波動不敏感，可用于等濃度洗脫，也可用于梯度洗脫。

姜麗麗等建立黃芪干根中HPLC-UV法測定黃芪甲苷的方法，比較蒙古黃芪、野生黃芪和膜莢黃芪3種不同來源樣本的黃芪甲苷含量。采用HPLC-UV法，色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈∶水（32∶68），流速1.0 ml/min，檢測波長203 nm。黃芪甲苷在0.05～0.50 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999），平均回收率為98.216%（RSD=2.85%）;黃芪甲苷含量為野生黃芪>膜莢黃芪≈蒙古黃芪。

1.4 UPLC-MS法

用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS法）測定物質(zhì)含量，具有準(zhǔn)確、快速、高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可用于黃芪中黃芪甲苷的快速測定，提高分析效率。

夏義平將黃芪用甲醇-氨水（3：1，V/V）超聲提取30 min，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，以m/z 785.4/143.108和m/z 785.4/473.391為定性離子對，m/z 785.4/143.108為定量離子對，用UPLC-MS外標(biāo)法測定黃芪中黃芪甲苷含量。測定結(jié)果顯示：黃芪甲苷在60.0～12 000 ng/ml濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系（r=0.999 3），平均回收率91.7%，最低檢測限68.2 μg/kg。該方法具有簡便、快速和靈敏度高的特點(diǎn)，可用于黃芪中黃芪甲苷測定。

1.5 HPLC-DAD-ELSD法

研究表明，皂苷和黃酮是黃芪的主要成分，但皂苷類化合物沒有紫外吸收或只在200 nm處有微弱吸收。因此，單用二極管陣列檢測器（DAD）無法同時(shí)測出黃芪中這兩類不同性質(zhì)的化合物。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）是一種通用型檢測器，特別適用于沒有紫外吸收的皂苷類化合物測定。

王亞麗等建立HPLC-DAD-ELSD同時(shí)測定黃芪藥材中4個(gè)黃酮類成分（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）和6個(gè)皂苷類成分（黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ）含量的方法，比較7批不同產(chǎn)地的黃芪藥材中效成分含量。色譜柱選用Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.3%冰醋酸（A）-乙腈（B）梯度洗脫，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度60 ℃，供氣壓力25 psi。該條件下10個(gè)成分的分離度良好，在對應(yīng)線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.6 近紅外光譜法

戰(zhàn)皓等采用近紅外漫反射光譜法對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量進(jìn)行快速無損檢測。以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析值為參比，采用偏最小二乘法建立黃定量分析模型。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷近紅外光譜經(jīng)多元散射校正（MSC）+一階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay卷積平滑預(yù)處理后模型最優(yōu)，模型參數(shù)R2為0.826 6，RMSEP值為0.022 7，校正集R2為0.863 5，RMSEC值為0.019 0;黃芪甲苷近紅外光譜經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)+Savitzky-Golay卷積平滑預(yù)處理后模型最優(yōu)，模型參數(shù)R2為0.854 8，RMSEP值為0.006 41，校正集R2為0.796 3，RMSEC值為0.007 99。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法可快速、準(zhǔn)確的對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量進(jìn)行檢測。此外，通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，甘肅產(chǎn)黃芪與其他產(chǎn)地黃芪差異不大，排除甘肅產(chǎn)黃芪后，山西、四川和吉林的樣本區(qū)分度較高。

1.7 聲光可調(diào)-近紅外漫反射光譜法

近紅外漫反射光譜法作為一種快速分析方法，具有快速、無損、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，可直接測定固體、液體和氣體樣品，無需復(fù)雜的前處理過程。應(yīng)用聲光可調(diào)-近紅外漫反射光譜法結(jié)合偏最小二乘法，建立快速通用的多指標(biāo)測定方法。

任緒華等采用聲光可調(diào)-近紅外漫反射光譜法結(jié)合偏最小二乘法建立預(yù)測黃芪藥材中含量的定量模型（作為預(yù)測值）。根據(jù)參考值采集60批藥材樣品，用一階導(dǎo)數(shù)聯(lián)合平滑降噪法預(yù)處理光譜，水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量預(yù)測的最佳波段分別為

1 100～2 300、1 080～2 160、1 170～2 230 nm。分析結(jié)果顯示，水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法學(xué)考察符合要求。水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷定量模型校正均方根偏差分別為0.132 3，

0.006 6，0.002 5，預(yù)測均方根偏差分別為0.237 1，

0.016 3，0.004 7，校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.975 9，0.953 3，0.968 0;定量模型內(nèi)部驗(yàn)證偏差分別為1.43%，1.90%，1.84%，外部驗(yàn)證偏差分別為1.73%，2.68%，2.71%。

1.8其他方法

除以上含量測定方法外，也有很多研究采用了其他技術(shù)，如高效毛細(xì)管電泳法、近紅外漫反射光譜法、反相高效液相色譜法、薄層比色法、薄層掃描法等，均取得了較好效果。

2 結(jié)語

黃芪是一類藥食兼用的傳統(tǒng)天然植物，具有很高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值，而黃芪甲苷是黃芪中的有效成分之一。因此，開展黃芪中黃芪甲苷的含量測定方法研究，對于黃芪資源的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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Abstract： This article analyzed the research progress on the determination method of astragaloside in Astragalus menmbranaceus on the basis of summarizing the methods for determination of astragaloside in astragalus at home， including HPLC-ELSD， HPLC/ESI-MS， HPLC-UV， UPLC-MS， HPLC-DAD-ELSD， etc. The purpose is to provide a theoretical reference for carrying out further correlation study of Astragalus menmbranaceus.

Key words： astragaloside; content determination; Astragalus membranaceus; HPLC-ELSD; HPLC/ESI-MS