酶的制備與分析

姜聯(lián)合 編譯

（中國科學(xué)院植物研究所 北京 100093）

酶類是所有生物體自然產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)。作為催化劑，它們能將大的復(fù)雜的結(jié)合物分解為較小的因子，從而在機(jī)體中更易被利用。同樣，大量的復(fù)合物需要小分子酶類來分解。日常所知的洗衣液、胰島素等都是酶類的一種，食品、藥品、化妝品都有酶的影子。酶是怎樣產(chǎn)生的？又有哪些類別，都應(yīng)用在何處？一起來制作一個(gè)生物反應(yīng)器，學(xué)習(xí)檢測分析酶類的方法。

1 背景知識

根據(jù)酶類分解的物質(zhì)對酶進(jìn)行分類。例如，纖維素酶能將纖維素分解為單糖；蛋白酶是一種能將明膠這類物質(zhì)分解的酶類；過氧化氫酶能分解過氧化氫：H2O2→2H2O+O2。

當(dāng)處于合適的溫度和pH值時(shí)，酶類才具有活性?？筛鶕?jù)這些特點(diǎn)考慮酶類是否能運(yùn)用在商業(yè)中。商業(yè)上使用的酶類都是從生物反應(yīng)器中的細(xì)菌和真菌體內(nèi)分離得到的。

生物反應(yīng)器是能繁殖大量微生物、生產(chǎn)所需產(chǎn)物的大容器。所需產(chǎn)物可以是醫(yī)藥行業(yè)所需的蛋白質(zhì)，例如糖尿病患者所需的胰島素；也可以是工業(yè)上所需要，用于軟化紙張、制作奶酪，或者是讓藍(lán)色牛仔服褪色；也可能是家庭所需的如用于軟化肉類的蛋白質(zhì)酶和洗衣液。生物反應(yīng)器必須包括以下條件：首先，必須能被完全滅菌；其次，能提供一個(gè)微生物繁殖并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物的環(huán)境；有一個(gè)進(jìn)氣口、一個(gè)排氣口、一個(gè)加樣口，以及一個(gè)安置測量電極的路徑。影響生物反應(yīng)器效率的因素包括：培養(yǎng)物的純度、使用的介質(zhì)、溫度、pH值、溶氧量和二氧化碳含量。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

1）描述能影響微生物生長和代謝產(chǎn)物成分的因子；

2）掌握檢測現(xiàn)有酶類的方法。

3 裝備生物反應(yīng)

3.1 實(shí)驗(yàn)材料 衛(wèi)生紙、5 L 10%消毒液、5 L桶；1.25 L飲料瓶（空的且潔凈）、玻璃棒或鈍探針、酒精燈、1 m潔凈的水管、氣石、鋒利的剪刀或刀片、硅膠塞、15 L無菌水、橡皮圈、大紙夾鑷子、燒杯、液體酒精、裝在密封瓶子里的消毒棉（用鋁箔紙封口，在160℃烘箱中滅菌2 h）、空氣泵。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1）用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實(shí)驗(yàn)臺；

2）用酒精燈加熱鈍探針或玻璃棒的一端，在飲料瓶的上端打3個(gè)等距的孔，每個(gè)孔將安裝干凈的水管；

3）用剪刀或刀片將水管切成以下長度：排氣管12 cm、上樣管30 cm、充氣管50 cm；

4）將每個(gè)水管插到對應(yīng)的孔中（圖1）：排氣管應(yīng)將一半以上插入瓶中，上樣管應(yīng)插入到接近卻不碰到瓶底，充氣管應(yīng)該接觸到瓶底；

圖1

5）將接通空氣的管子與充氣管的末端接在一起；

6）用硅膠塞將管口密封，可用橡膠圈將管子固定；放置 24～48 h；

7）帶上手套；

8）用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實(shí)驗(yàn)臺；

9）在燒杯中加入液體酒精，并將鑷子浸沒其中；

10）將桶里加入10%消毒液，將瓶子和瓶蓋浸沒在其中至少10 min；

11）倒掉消毒液；

12）用冷的無菌水沖洗3次；

13）蓋上瓶蓋，用夾子夾住折過來的上樣管達(dá)到密封效果；

14）用滅菌的鑷子將消毒棉輕輕塞入進(jìn)排氣管和充氣管的末端，并將充氣管與空氣泵連接。

4 生物反應(yīng)器接種

4.1 實(shí)驗(yàn)材料 天平、2個(gè)稱量盤、15 g糖、1 g酵母膏、350 mL蒸餾水、加熱板、400 mL帶塞子的錐形瓶、漏斗、1 L 10%消毒液、3 L無菌水；pH試紙或者 pH 計(jì)、0.1 mol／L HCl、1 袋（7 g）活性酵母（釀酒酵母）。

4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

15）用衛(wèi)生紙蘸取稀釋的消毒劑，擦拭實(shí)驗(yàn)臺；

16）將350 mL蒸餾水加入錐形瓶；

17）用天平稱取糖與酵母膏；

18）將糖和酵母膏加入錐形瓶并加熱至沸騰；

19）測量溶液的pH值，如果高于5.4，就慢慢加入鹽酸讓pH值降至5.4；

20）煮沸15 min，然后蓋上蓋子，冷卻；

21）用桶中稀釋的消毒液將漏斗消毒，然后用無菌水清洗3次；

22）快速打開瓶蓋，將漏斗插入，將肉湯灌入生物反應(yīng)器；

23）蓋上蓋子并開始充氣，這便能產(chǎn)生一個(gè)正壓，使得其他的微生物很難進(jìn)入；

24）再次將蓋子打開，插入漏斗，并加入一袋酵母粉；

25）將蓋子蓋緊。

5 分析酶的產(chǎn)量

5.1 實(shí)驗(yàn)材料 10 mL注射器、消毒棉、3% 過氧化氫液、移液管、帶蓋子的瓶子（比微量離心管大的）、2個(gè)顯微鏡載玻片、1個(gè)蓋玻片、微量離心管、秒表或計(jì)時(shí)器、在培養(yǎng)皿中倒入5 mm厚的含有紅色食用色素的明膠、滴管、2根試管、試管架、將0.33 g肉類軟化劑溶解在10 mL水中、透射光學(xué)顯微鏡（物鏡放大倍數(shù)為40倍）、100 mL 10%消毒液、100 mL量筒。

5.2 實(shí)驗(yàn)步驟 分析從接種的當(dāng)天及其后3 d分別進(jìn)行。必須每天攪拌樣品數(shù)次。

26）打開上樣管的夾子，接上10 mL注射器并抽取大約3 mL發(fā)酵液棄去；

27）抽取10 mL發(fā)酵液。夾上夾子，取下注射器并塞上消毒棉。

6 過氧化氫酶分析

28）向微量離心管中加入0.5 mL發(fā)酵液；

29）加入0.5 mL 3%的過氧化氫溶液；

30）立刻蓋上離心管的蓋子然后置于一個(gè)帶有蓋子的容器中；

31）如果產(chǎn)生大量的氣泡，則說明含有過氧化氫酶；

32）記錄下從開始到產(chǎn)氣量達(dá)到最高的時(shí)間，如果超過半小時(shí)即可停止分析；

33）將用過的離心管放入裝有消毒液的桶中。

7 蛋白酶分析

34）用吸管從含有明膠的培養(yǎng)皿中取適量明膠放入一根試管中；

35）重復(fù)上述操作，將明膠放入第2根試管；

36）在第1根試管中加入1 mL發(fā)酵液；

37）在第2根試管中加入1 mL肉湯；

38）記錄溶解明膠塊所需的時(shí)間；

39）將用過的試管放在裝有消毒液的桶中。

8 顯微鏡觀察

40）在載玻片上滴1～2滴培養(yǎng)物，蓋上蓋玻片；

41）將用過的注射器放入裝有消毒液的桶中；

42）調(diào)節(jié)透射顯微鏡至低倍鏡；

43）將載玻片放在顯微鏡載物臺上，畫下并標(biāo)記出所觀察到的；

44）調(diào)節(jié)顯微鏡至高倍鏡，畫下并標(biāo)記出所觀察到的；

45）將用過的玻片放在裝有消毒液的桶中。

9 思考題

1）微生物在需氧的液體環(huán)境中生長需要哪些必要的條件？（提供氧氣和攪拌。）

2）為什么在厭氧環(huán)境微生物不能產(chǎn)生酶類？（酶的產(chǎn)生是依賴ATP的合成代謝途徑，而氧氣形成是合成酶所需ATP的前提。）

3）舉例說明微生物產(chǎn)生的酶類和蛋白質(zhì)在工業(yè)上的應(yīng)用。（答案不唯一，在背景知識中提到過。）

10 現(xiàn)實(shí)生活中生物反應(yīng)器的應(yīng)用

生產(chǎn)酶類：酶類被廣泛用于食品行業(yè)、制造業(yè)、制藥業(yè)和家庭使用的化學(xué)物品中。