K-ras、PIK3CA 基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系及相關(guān)性分析

劉鑫，趙任

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院普外科，上海 201801

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展受多種因素影響并有多種基因參與，其中抑癌基因功能障礙和癌基因表達(dá)均可能誘發(fā)結(jié)直腸癌，因此，從分子水平探討結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制已成為現(xiàn)階段臨床研究的重要方向[1]。K-ras基因?qū)儆赗AS家族，研究證實(shí)，結(jié)直腸癌患者K-ras基因的突變率＞40%，且參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。結(jié)直腸癌患者的K-ras基因突變狀態(tài)與其下游基因突變的靶向治療效果之間可能存在一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不明確[4-5]。本研究探討了K-ras基因及其下游基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α（phosphatidylino-sitol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系及K-ras、PIK3CA二者表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年1月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院診治的結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行結(jié)直腸癌切除術(shù)，且術(shù)后病理檢查確診為結(jié)直腸癌；②接受了K-ras、PIK3CA基因突變檢測；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前已行放化療；②合并其他惡性腫瘤。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入110例結(jié)直腸癌患者，其中男62例，女48例；年齡為27～67歲，中位年齡為45.5歲；結(jié)腸癌患者56例，直腸癌患者54例。

1.2 試劑和儀器

K-ras、PIK3CA基因突變檢測試劑盒均購于北京中杉生物有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物購于中國生物技術(shù)有限公司，PCR DNA提取試劑盒購于南京建成生物研究所，PCR擴(kuò)增儀購于美國BD公司，ABI3730XL基因測序儀購于德國羅氏公司，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購于美國GE公司，DYY-6C型電泳儀購于上海六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取病理科保存的納入患者的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，石蠟包埋后常規(guī)切片，10～15 μm厚度切片，共20片，置于4℃冰箱保存。依據(jù)PCR DNA提取試劑盒說明書的具體步驟，從切片中提取DNA，在既定的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定用瓊脂凝膠電泳，產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序反應(yīng)，依據(jù)Mutation 2.71版軟件判讀基因突變情況[6]?；驒z測送益善醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)

分析結(jié)直腸癌患者的K-ras、PIK3CA基因突變情況，并比較不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因的突變率，分析K-ras、PIK3CA基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變情況

K-ras基因突變率為37.27%（41/110），其中Exon2-codon12位點(diǎn)突變28例，Exon2-condon13位點(diǎn)突變13例；PIK3CA基因突變率為18.18%（20/110），其中Exon21-codon1047位點(diǎn)突變12例，Exon10-codon545位點(diǎn)突變7例，Exon-codon542位點(diǎn)突變1例。

2.2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變率的比較

腫瘤直徑≥5 cm、直腸癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的K-ras基因突變率分別明顯高于腫瘤直徑＜5 cm、結(jié)腸癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、分化程度的結(jié)直腸癌患者的K-ras基因突變率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變情況的比較（n=110）

2.3 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者PIK3CA基因突變率的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的PIK3CA基因突變率明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤類型、分化程度的結(jié)直腸癌患者的PIK3CA基因突變率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者PIK3CA基因突變情況的比較（n=110）

2.4 K-ras、PIK3CA基因表達(dá)的相關(guān)性分析

K-ras基因與PIK3CA基因表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.514，P＜0.01）。（表3）

表3 K-ras、PIK3CA基因表達(dá)的相關(guān)性分析（n=110）

3 討論

現(xiàn)代分子生物學(xué)研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多階段參與的復(fù)雜過程，涉及各種抑癌基因的失活及原癌基因的激活，此外凋亡調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)基因等也在其中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。

RAS基因?qū)儆谥匾脑┗颍芏喾N細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，能夠調(diào)控基因表達(dá)及細(xì)胞的分化、分裂、代謝、凋亡等過程[9]。K-ras是RAS基因中對(duì)腫瘤影響最大的基因，正常時(shí)，可調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時(shí)，能夠?qū)е录?xì)胞持續(xù)生長并抑制細(xì)胞凋亡。近年來，關(guān)于K-ras多集中于胃癌[10]、乳腺癌[11]中，關(guān)于腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究逐漸增多，但關(guān)于結(jié)直腸癌[12]的研究較少。另外，K-ras可參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)K-ras基因突變時(shí)，導(dǎo)致RAS蛋白異常，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，細(xì)胞增殖失控而發(fā)生癌變[13]。

K-ras下游的PIK3CA基因是位于3號(hào)染色體上的原癌基因，共有20個(gè)外顯子，約80%的PIK3CA基因突變發(fā)生于螺旋區(qū)和激酶區(qū)[14]。關(guān)于PIK3CA的研究主要集中于PIK3CA信號(hào)通路上。研究提示PIK3CA信號(hào)通路可參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[15]。PIK3CA基因在結(jié)直腸癌中多與K-ras、BRAF等發(fā)生交叉突變[16]。本研究結(jié)果顯示，K-ras基因突變率為37.27%，PIK3CA基因突變率為18.18%，提示結(jié)直腸癌患者的K-ras、PIK3CA的突變率較高。

進(jìn)一步分析兩種基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥5 cm、直腸癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的K-ras基因突變率分別明顯高于腫瘤直徑＜5 cm、結(jié)腸癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜0.01），TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的PIK3CA基因突變率高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜0.01），說明K-ras、PIK3CA基因的突變率可能隨著結(jié)直腸癌的發(fā)展而升高。西妥昔單抗和帕尼單抗是臨床結(jié)直腸癌分子靶向治療中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）單克隆抗體。研究顯示，EGFR單克隆抗體治療效果不佳與腫瘤患者K-ras基因突變率高有關(guān)[4]。K-ras基因高突變后可導(dǎo)致EGFR無法繼續(xù)調(diào)節(jié)相應(yīng)的信號(hào)通路，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞的過度增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這也可能是臨床結(jié)直腸癌的分子靶向治療耐藥的主要機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，K-ras基因與PIK3CA基因表達(dá)呈正相關(guān)，說明K-ras基因突變與PIK3CA基因突變有一定的相關(guān)性。PIK3CA是磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，其突變可能對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用。K-ras是調(diào)控EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要基因，K-ras基因突變后，能夠自動(dòng)啟動(dòng)下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，無需接受EGFR信號(hào)即可異常激活相關(guān)通路。此外，研究發(fā)現(xiàn)，即使RAS野生型腫瘤患者在使用EGFR單克隆抗體治療過程中，也會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥突變，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[17-19]，因此，結(jié)直腸癌治療前的RAS基因監(jiān)測對(duì)提高治療效果及降低耐藥性具有重要的作用。PI3K/AKT在細(xì)胞的增殖、生長、凋亡以及血管生成、自噬等過程中發(fā)揮著極其重要的作用，是細(xì)胞內(nèi)EGFR單克隆抗體治療的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通路異?？烧T發(fā)腫瘤、神經(jīng)病變、自身免疫性疾病等[20]；PIK3CA是PI3K/AKT信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵原癌基因，K-ras與PIK3CA關(guān)系密切。

綜上所述，K-ras、PIK3CA基因突變與結(jié)直腸癌患者的臨床特征有關(guān)，兩者有一定的相關(guān)性。