全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析不同季節(jié)釀造的青稞酒揮發(fā)性組分特征

劉志鵬，車富紅，李善文，馮聲寶，陳雙，徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(青海互助青稞酒股份有限公司，青海 海東，810500)

青稞酒是我國(guó)青海及西藏地區(qū)特產(chǎn)的一種清香型白酒，因其獨(dú)特的地理環(huán)境、釀酒原料和“清蒸清燒四次清”生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)，形成了有別于其他清香型白酒的獨(dú)特風(fēng)格[1]。青稞酒的風(fēng)味研究始于20世紀(jì)90年代，彭秉順等[2]分析了青稞酒與其他幾種香型白酒的主要微量成分，認(rèn)為乙酸乙酯和乳酸乙酯是青稞酒的主體香。2012年，許錦文等[3]報(bào)道了青稞酒中主要醇類和酯類物質(zhì)的含量。2014年，高文俊等[4]使用氣相色譜-嗅聞儀聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-olfactometry, GC-O)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-mass spectrometry, GC-MS)在青稞酒中鑒定出66種香氣化合物，通過(guò)定量分析和香氣活力值分析(odor activity value，OAV)確定了27種重要的香氣物質(zhì)。但相比其他香型白酒，對(duì)青稞酒揮發(fā)性風(fēng)味組分的研究相對(duì)較少，形成青稞酒特征香氣的風(fēng)味化學(xué)組成尚不清晰。白酒作為一種典型的多菌種自然發(fā)酵產(chǎn)品，生產(chǎn)環(huán)境是影響其風(fēng)味的重要因素[5]。青稞酒主要釀造地在青藏高原地區(qū)，該地區(qū)屬大陸寒溫帶氣候，冬季最低氣溫為-20 ℃，夏季最高溫度為20 ℃，季節(jié)差異明顯。這種季節(jié)環(huán)境的變化導(dǎo)致不同季節(jié)釀造的青稞酒的風(fēng)味具有明顯差異，但是形成這種風(fēng)格差異的風(fēng)味物質(zhì)目前尚不清楚。

白酒的香氣由上千種不同的組分共同決定[5]，目前白酒中揮發(fā)性化合物的研究通常采用傳統(tǒng)一維GC-MS[4,6-8]。然而一維GC由于分離能力有限無(wú)法完成復(fù)雜基質(zhì)中大量揮發(fā)性組分的有效分離，常常需要結(jié)合多種樣品前處理方法和預(yù)分離手段[9]。全二維氣相色譜技術(shù)(comprehensive two-dimensional gas chromatography, GC×GC)通過(guò)2種極性不同的氣相色譜柱實(shí)行正交分離，相比一維氣相色譜具備高峰容量、高靈敏度和有序色譜的優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)榻馕霭拙频葟?fù)雜樣品中的組分提供有效分離能力[10-12]。通過(guò)全二維氣相色譜分離結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜(time-of-flight mass spectrometry, TOFMS)檢測(cè)，在白酒中能夠分離檢測(cè)到上千個(gè)色譜峰[13-16]。大量色譜峰的檢出，對(duì)化合物的鑒定是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。GC×GC-TOFMS分析的結(jié)果往往首先通過(guò)儀器自帶的軟件結(jié)合化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)的質(zhì)譜比對(duì)鑒定，給出初步的鑒定結(jié)果，如徐平等[12]通過(guò)GC×GC- TOFMS分析軟件在瀘州老窖中鑒定出1 000多種組分。但由于白酒組分的復(fù)雜性，軟件自動(dòng)處理給出的僅是可能的鑒定結(jié)果，鑒定誤差往往較大，因此還需要進(jìn)一步驗(yàn)證分析。ZHU等[11]通過(guò)GC×GC-TOFMS分析軟件的數(shù)據(jù)處理結(jié)合同系物出峰規(guī)律在茅臺(tái)酒中鑒定出528種揮發(fā)性組分。陳雙等[14]采用多級(jí)鑒定策略在芝麻香白酒中確認(rèn)了可信度較高的340種揮發(fā)性化合物。為提高全二維鑒定結(jié)果的可靠性，保留指數(shù)比對(duì)和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)等方法已逐步用于復(fù)雜樣品中化合物的鑒定分析。WELDEGERGIS等[17]和KUPSKA等[18]通過(guò)比對(duì)質(zhì)譜和保留指數(shù)在葡萄酒中初步鑒定出上百種揮發(fā)性組分，并對(duì)其中部分化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，該方法對(duì)大量色譜峰鑒定來(lái)講是一種有效策略。但白酒中二維色譜化合物鑒定還未見(jiàn)采用保留指數(shù)比對(duì)和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的報(bào)道。

本研究采用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)結(jié)合GC×GC-TOFMS解析了青稞酒揮發(fā)性組分，通過(guò)對(duì)鑒定方法的優(yōu)化確定了青稞酒中揮發(fā)性組分的特征，進(jìn)一步比較了不同季節(jié)釀造的青稞酒揮發(fā)性組分的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

本研究采用的樣品為青?；ブ囡乒煞萦邢薰咎峁┑亩囡圃?2017—2018年)，分別在春夏秋冬4個(gè)季節(jié)(4、7、11和2月)入窖。從每個(gè)季節(jié)釀造的4個(gè)窖池中的酒樣各取100 mL并混合，作為代表酒樣，酒精度為59.5%～65.5% vol。

1.1.2 試劑

用于定性的標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，購(gòu)自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)， TCI America (Portland, OR, USA)。C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴和乙醇(色譜級(jí))， Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。NaCl(化學(xué)純)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

純水儀，Millipore公司；頂空固相微萃取多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)(MPS2)，德國(guó)Gerstel公司； 50/30 μm三相萃取頭DVB/CAR/PDMS，美國(guó)Supelco公司；全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(GC×GC-TOFMS, Pegasus?4D)，美國(guó)LECO公司； 7890B氣相色譜儀、一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國(guó)安捷倫公司；二維色譜柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25μm)，美國(guó)Restek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)試驗(yàn)方法

試驗(yàn)方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化建立的方法進(jìn)行[4]。將2 mL白酒樣品和8 mL超純水及3 g NaCl置于20 mL頂空瓶中，并添加10 μL內(nèi)標(biāo)(正己醇-d13，終質(zhì)量濃度為402 μg/L)，由MPS2進(jìn)行HS-SPME操作。樣品在50 ℃下平衡5 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為400 r/min。萃取完成后揮發(fā)性化合物和半揮發(fā)化合物于GC進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸附5 min，10∶1分流，進(jìn)行GC×GC-TOFMS分析。相同條件下每個(gè)樣品各進(jìn)樣3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS分析方法

根據(jù)以下升溫程序進(jìn)行分離：起始溫度45 ℃保持3 min后，以4 ℃/min升溫至150 ℃并保持2 min；以6 ℃/min升溫至200 ℃,然后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。第2個(gè)烘箱的溫度全程保持比一維烘箱高5 ℃。調(diào)制補(bǔ)償溫度為20 ℃，調(diào)制周期為4 s(熱脈沖時(shí)間0.8 s)。樣品運(yùn)行采用恒流模式，載氣為高純He(純度>99.999 5%)，流速為1 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源電壓為70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃,檢測(cè)器電壓為1 430 V,采集質(zhì)量數(shù)范圍為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

青稞酒中揮發(fā)性化合物的鑒定：試驗(yàn)采集的TOFMS數(shù)據(jù)由LECO公司軟件ChromaTOF進(jìn)行處理。自動(dòng)識(shí)別信噪比大于50的色譜峰，然后進(jìn)行自動(dòng)解卷積和質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)，質(zhì)譜庫(kù)為NIST 2014和Wiley 9。12個(gè)樣品根據(jù)春夏秋冬分為4組，采用ChromaTOF軟件統(tǒng)計(jì)比較功能并對(duì)齊色譜峰。峰對(duì)齊后，導(dǎo)出1個(gè)新的峰表，包含一維時(shí)間、二維時(shí)間和定量離子等信息。選擇3個(gè)平行樣品中至少出現(xiàn)2次的峰作為這類酒樣中存在的組分。篩選相似度大于700的組分，并剔除沒(méi)有風(fēng)味貢獻(xiàn)的烷烴類化合物、色譜柱流出物和含硅類化合物等，作為初步鑒定結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，相同條件下分析一系列正構(gòu)烷烴(C7-C30)，確定每個(gè)化合物的一維色譜柱保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，偏差在30以內(nèi)的化合物作為可信度較高的結(jié)果[17]。通過(guò)在模擬酒溶液中添加真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)比樣品與模擬酒溶液中色譜峰的一維時(shí)間和二維時(shí)間，篩選一維時(shí)間偏差在4 s內(nèi)(1個(gè)調(diào)制周期)，二維時(shí)間偏差在0.1 s內(nèi)的組分作為最終確認(rèn)的鑒定結(jié)果。

青稞酒中揮發(fā)性化合物相對(duì)含量的計(jì)算：揮發(fā)性組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與內(nèi)標(biāo)濃度的乘積作為該組分在稀釋酒樣中的相對(duì)含量，該數(shù)值擴(kuò)大5倍即為該物質(zhì)在樣品中的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS技術(shù)解析青稞酒中揮發(fā)性組分

通過(guò)GC×GC-TOFMS在冬季釀造的青稞酒中共分離檢測(cè)到4 491個(gè)色譜峰，圖1展示了冬釀青稞酒中揮發(fā)性組分的全二維分析譜圖，每一個(gè)黑點(diǎn)代表鑒定的一個(gè)化合物。

圖1 青稞酒樣品HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析的總離子流色譜圖(A)及部分細(xì)節(jié)圖(B，C)，化合物編號(hào)對(duì)應(yīng)附表S1(圖中黑點(diǎn)表示一個(gè)色譜峰)

Fig.1 Analytical ion chromatogram contour plot obtained for the HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of a Qingke liquor (A) and detailed portions (B, C), compound numbers correspond to table S1

232個(gè)化合物在一維共流出，部分在二維得到分離。在圖2-A中，2-十一醇、(E,E)-2,4-壬二烯醛、十二醛和2-噻吩甲醛4個(gè)化合物在一維色譜柱上共流出，2-十一醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛在二維色譜柱上同時(shí)析出，使得定性分析和定量分析都十分困難。2-十一醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛的質(zhì)譜差異較大(圖2-B)，基于質(zhì)譜差異的解卷積功能可以在這種情況下區(qū)分這2個(gè)化合物。因此，共流出組分之間的干擾得到了有效降低，GC×GC可以檢測(cè)到更多的色譜峰。

盡管如此，白酒作為一種組分十分復(fù)雜的體系，存在許多保留時(shí)間接近且質(zhì)譜相似的化合物。如圖3-A所示，戊酸乙酯和3-庚酮的保留時(shí)間比較接近，且兩者質(zhì)譜十分相似(圖3-B，圖3-C)。戊酸乙酯作為白酒中重要的香氣物質(zhì)，濃度遠(yuǎn)高于3-庚酮[4]，戊酸乙酯的質(zhì)譜與3-庚酮質(zhì)譜存在著部分重疊，造成定性分析和定量分析較困難。3-庚酮在冬季樣品中經(jīng)過(guò)軟件自動(dòng)處理鑒定為3-庚酮，而在夏季樣品中錯(cuò)誤鑒定為戊酸乙酯。這可能是因?yàn)橄募緲悠分形焖嵋阴ズ?-庚酮的質(zhì)譜干擾比較嚴(yán)重。統(tǒng)計(jì)比較(statistic compare)中的峰對(duì)齊功能能夠通過(guò)比較所有樣品中該色譜峰的質(zhì)譜得到一致的結(jié)果，降低了出現(xiàn)偶然誤差的可能性，該方法一定程度上解決了保留時(shí)間接近和質(zhì)譜相似情況下如何準(zhǔn)確鑒定的問(wèn)題。

冬季青稞酒通過(guò)HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析，基于軟件積分解卷積識(shí)別出4 491個(gè)色譜峰，通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)選擇相似度大于700的色譜峰得到1 494個(gè)組分，進(jìn)一步通過(guò)化合物出峰規(guī)律比對(duì)和保留指數(shù)比對(duì)初步鑒定出393個(gè)組分，并對(duì)187個(gè)組分進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，其中184個(gè)物質(zhì)的一維時(shí)間偏差在4 s內(nèi)，二維時(shí)間偏差在0.1 s內(nèi)，最終在冬季青稞酒中鑒定出390種揮發(fā)性化合物。通過(guò)以上鑒定方式，在4個(gè)季節(jié)釀造的青稞酒樣品中共鑒定出448種揮發(fā)性化合物。其中酯類最多(129種)，其次是羰基化合物(119種)、醇類(67種)、萜烯類(53種)、呋喃類(27種)、酸類(17種)、含硫化合物(11種)、內(nèi)酯類(10種)、含氮化合物(9種)和揮發(fā)性酚類(6種)，如表1所示。酯類和羰基化合物作為青稞酒中種類最多的化合物，這一結(jié)果與其他白酒研究結(jié)論一致[11-12]，說(shuō)明這幾類化合物是白酒中普遍存在的揮發(fā)性組分。酯類和羰基化合物也是青稞酒中最重要的香氣成分，包括3-甲基丁醛、丁酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸異戊酯，主要呈水果香和花香，對(duì)青稞酒整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[19]。一些微量的乙酯類化合物對(duì)白酒的香氣也有一定的影響，比如4-甲基戊酸乙酯，其呈現(xiàn)草莓香氣，香氣閾值極低，只有0.01 μg/L(水中)[20]；肉桂酸乙酯呈現(xiàn)蜂蜜和肉桂的香氣，香氣閾值僅有1 μg/L[21]。(E)-2-辛烯醛作為豉香型白酒中的關(guān)鍵香氣化合物，呈現(xiàn)出油脂的香氣，在46%乙醇水溶液中的香氣閾值僅有15.1 μg/L[6]。

圖2 青稞酒HS-SPME- GC×GC -TOFMS分析節(jié)選1個(gè)調(diào)制周期的4個(gè)化合物色譜峰(A)和4個(gè)化合物的解卷積質(zhì)譜(B)

Fig.2 Modulated peaks of four compounds found in Qingke liquor acquired by HS-SPME-GC×GC-TOFMS(A) and deconvoluted mass spectra of 4 compounds(B)

圖3 青稞酒中2個(gè)化合物的色譜峰(A)和2個(gè)化合物的解卷積質(zhì)譜(B)

Fig.3 Peaks of two compounds found in Qingke liquor(A) and (B) deconvoluted mass spectra of 2 compounds(B)

表1 青稞酒中HS-SPME- GC×GC-TOFMS分析鑒定的化合物統(tǒng)計(jì)

除了這些在白酒中普遍存在的化合物，本研究在青稞酒中還鑒定出了53種萜烯類化合物(表2)。圖4為青稞酒中萜烯化合物在二維色譜上的分布情況，主要包括萜烯、萜烯醇、萜烯醛、萜烯酮和萜烯氧化物等，其數(shù)量和種類都十分豐富。其中有43種在青稞酒中被首次鑒定。萜烯類化合物既是白酒中重要的一類香氣化合物，也是具有生理活性的一類重要物質(zhì)。部分青稞酒中鑒定出的萜烯化合物結(jié)構(gòu)式及香氣閾值如圖5所示。

圖4 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析發(fā)現(xiàn)的萜烯類化合物的總離子流色譜圖(圖中黑點(diǎn)表示一個(gè)色譜峰)

Fig.4 Contour plot obtained for the HS-SPME-GC× GC-TOFMS analysis of terpenoid compounds found in Qingke liquor, compound numbers correspond to table S1

其中β-大馬酮對(duì)白酒香氣有重要影響，具有蘋果、玫瑰和蜂蜜的香氣，其在白酒中的香氣閾值極低(0.12 μg/L)，是清香型白酒中十分重要的一種香氣化合物[4]。里那醇、香葉醇和香茅醇是具有花香特征的重要香氣物質(zhì)，它們的香氣閾值分別為13.1、120和300 μg/L[22]，這3個(gè)化合物對(duì)青稞酒特征香氣有重要貢獻(xiàn)作用。此外，土味素的香氣閾值極低，僅為0.1 μg/L，呈現(xiàn)出土腥味，是白酒中重要的異嗅物質(zhì)。除了香氣作用外，萜烯也是白酒的功能化合物，具有抗癌活性、抗菌活性和鎮(zhèn)痛活性等[23]。在青稞酒鑒定出的萜烯中，d-檸檬油精是柑橘精油的主要成分，一直被用作調(diào)香劑、食品添加劑，應(yīng)用于香料中，在抗癌方面也具有重要作用[23]。反式石竹烯、δ-杜松烯、β-紫羅蘭酮和橙花叔醇等具有體外抗腫瘤細(xì)胞活性的功能[24]。樟腦、4-萜烯醇、異佛爾酮、γ-古蕓烯、β-倍半水芹烯、α-姜黃烯和α-杜松醇等具有抗病毒、抗癌、抗炎癥等活性[24]。青稞酒中鑒定出的萜烯化合物不僅對(duì)風(fēng)味有重要影響，對(duì)青稞酒的健康價(jià)值也有一定的貢獻(xiàn)，但這些物質(zhì)的含量和功能還有待進(jìn)一步解析。

表2 青稞酒中HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定出的萜烯類化合物

注：RT1，一維色譜柱的保留時(shí)間；RT2，二維色譜柱的保留時(shí)間；相似度，樣品中分析物質(zhì)譜與NIST庫(kù)中質(zhì)譜的匹配值；LRIcal，計(jì)算的線性保留指數(shù)；LRIlit，來(lái)自NIST2018數(shù)據(jù)庫(kù)中的文獻(xiàn)報(bào)道線性保留指數(shù)；鑒定依據(jù)，RI鑒定基于保留指數(shù)比對(duì)，MS鑒定基于質(zhì)譜比對(duì)，STD基于真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對(duì)。

圖5 青稞酒中的萜烯類化合物結(jié)構(gòu)圖及香氣閾值。

Fig.5 Chemical structural and odor threshold of terpenes identified in Qingke liquor

注：β-環(huán)檸檬醛香氣閾值在水中測(cè)定[25]，其他萜烯類化合物香氣閾值均在46%乙醇水溶液中測(cè)定[4,22]。

2.2 不同釀造季節(jié)對(duì)青稞酒揮發(fā)性組分的影響

維恩圖(圖6)揭示了4個(gè)樣品中揮發(fā)性組分的相互關(guān)系，4個(gè)季節(jié)釀造青稞酒中的揮發(fā)性組分中有299個(gè)化合物被共同檢出，每一個(gè)酒樣特異檢出的化合物約有10個(gè)。

圖6 四個(gè)青稞酒樣品經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鑒定的化合物種類間的關(guān)系

Fig.6 Correlation of volatile compounds identified in 4 Qingke liquors analzed by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

將青稞酒中鑒定出的448種揮發(fā)性組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積相比，得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。隨后進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖7所示。2個(gè)主成分總計(jì)代表了所有變量的79.08%，代表了大部分的變量信息。通過(guò)PCA分析，不同季節(jié)的樣品得到了很好的區(qū)分，表明不同季節(jié)樣品的揮發(fā)性組分含量存在較為顯著的差異。

C-春季青稞酒；X-夏季青稞酒；Q-秋季青稞酒；D-冬季青稞酒

圖7 主成分分析區(qū)別4類樣品

Fig.7 PCA analysis for distinction between the 4 types of samples

為了進(jìn)一步分析不同季節(jié)釀造的青稞酒中揮發(fā)性風(fēng)味組分差異特征，通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U檢驗(yàn))分析青稞酒中448個(gè)揮發(fā)性組分相對(duì)含量的差異，發(fā)現(xiàn)4類樣品兩兩之間具有顯著差異(P<0.05)的化合物有312個(gè)。以312種化合物建立PLS-DA模型并得到變量投影重要性值(variable importance in the projection, VIP)大于1的83種化合物作為關(guān)鍵特征性組分，分析不同季節(jié)青稞酒揮發(fā)性組分的差異。根據(jù)83個(gè)特征組分的半定量數(shù)據(jù)，使用Pearson相關(guān)系數(shù)得到HCA結(jié)果，如圖8所示。4類青稞酒最大的差異是生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)境溫度不同，春季、夏季和秋季溫度較高，有利于微生物的生長(zhǎng)，適宜大量風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生積累，而冬季則相反。圖8組A中的化合物在夏季釀造的青稞酒中含量最高，其中β-大馬酮是清香型白酒的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，具有花香和蜂蜜的香氣，同時(shí)具有極低的香氣閾值(0.12 μg/L)[4]。也存在多種醛類物質(zhì)，如(Z)-2-癸醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(Z,Z)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中(E,E)-2,4-癸二烯醛呈脂肪香氣并具有極低的香氣閾值(7.71 μg/L)[6]，烯醛類物質(zhì)對(duì)夏釀青稞酒特征香氣具有重要貢獻(xiàn)作用。圖8組B中的化合物為春季釀造的青稞酒的特征組分，數(shù)量多且種類豐富，并呈現(xiàn)不同的香氣特征。其中1-辛烯-3-酮是呈類似蘑菇的香氣，具有極低的香氣閾值(0.016 μg/L)[26]。二甲基三硫是芝麻香白酒中重要的香氣化合物，具有爛白菜的香氣，香氣閾值為0.36 μg/L[7]。肉桂酸乙酯是葡萄酒中重要的香氣組分，呈現(xiàn)蜂蜜和肉桂的香氣，香氣閾值僅有1.1 μg/L[21]，這些物質(zhì)對(duì)春季釀造青稞酒的獨(dú)特風(fēng)味可能有較大貢獻(xiàn)。圖8組C中的化合物是秋季釀造青稞酒的特征組分，其中2,3-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪在醬香型白酒中有較高濃度[27]，主要呈現(xiàn)焙烤的香氣[28]。4-甲基戊酸乙酯呈現(xiàn)水果的特征香氣[7]，在水中的閾值只有0.01 μg/L[20]。2-壬酮具有甜香和水果香的特征香氣，香氣閾值為483 μg/L[28]。其他風(fēng)味物質(zhì)的香氣和含量還需進(jìn)一步解析。

圖8 4類樣品的83個(gè)顯著性差異化合物的熱圖分析和HCA聚類分析

Fig.8 Heat map and HCA clustering results of 83 compounds with a significant difference in the 4 types of Qingke liquor

注：A、B、C組分別為夏季、春季和秋季青稞酒特征組分。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析了青稞酒中揮發(fā)性組分特征。在軟件積分解卷積、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行化合物初步鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)化合物出峰規(guī)律比對(duì)、保留指數(shù)比對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的方式在青稞酒中鑒定出448種揮發(fā)性化合物。二維分離和解卷積功能有效提高了色譜峰的數(shù)量，檢測(cè)出的化合物數(shù)目遠(yuǎn)高于一維氣相色譜，顯示出卓越的峰容量?jī)?yōu)勢(shì)。此外，通過(guò)峰對(duì)齊功能比較分析物在多個(gè)樣品間的質(zhì)譜進(jìn)一步降低了出錯(cuò)率。青稞酒中的揮發(fā)性組分除了白酒中普遍存在的酯、醇、酸和羰基化合物外，還存在53種萜烯類化合物，其中43種首次被鑒定出，這些組分對(duì)青稞酒獨(dú)特的香氣特征具有重要貢獻(xiàn)作用。不同季節(jié)釀造的青稞酒中揮發(fā)性組分含量上的差異造成了風(fēng)味的明顯不同，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析找到了83個(gè)化合物。該方法可以用來(lái)鑒定白酒揮發(fā)性組分，尋找揮發(fā)性組分與白酒品質(zhì)之間的關(guān)系。