左氧氟沙星聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌防耐藥突變濃度的影響＊

張欣悅，邊鋒芝，柳春梅，楊 菁，張華金，宮 英，孫成春

鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院ICU、神經(jīng)外科及呼吸科患者發(fā)生肺部感染致死的主要因素［1］。近年來(lái)，隨著各種廣譜抗生素的濫用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況日益嚴(yán)重，使其成為醫(yī)院感染最嚴(yán)重的病原菌之一。由于碳青霉烯類藥物在治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的出色表現(xiàn)，使其應(yīng)用范圍和頻率加快，直接導(dǎo)致院內(nèi)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌 （Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）感染率呈上升趨勢(shì)。一旦感染CRAB，常發(fā)生定植感染而不易根治，給臨床治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)［2，3］。

Drlica等［4］基于對(duì)耐藥菌的深入研究，創(chuàng)造性地提出防突變濃度 （mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，成為近年來(lái)臨床有效抑制細(xì)菌耐藥及制定應(yīng)對(duì)策略的參考依據(jù)和該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MPC是評(píng)價(jià)抗菌藥物防耐藥能力的新指標(biāo)，特指防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌濃度。MSW是指最低抑菌濃度（MIC）到MPC之間的范圍?；谠摾碚摰年U述，當(dāng)兩種或兩種以上藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)菌需要同時(shí)突變兩次或多次才能產(chǎn)生突變菌株。由于細(xì)菌連續(xù)突變兩次以上的概率極低，從而使MSW縮小或關(guān)閉。目前關(guān)于LVX聯(lián)合CFS對(duì)CRAB的MPC的影響研究少有報(bào)道。該研究通過(guò)體外LVX聯(lián)合CFS對(duì)CRAB的MPC影響，探討抗菌藥物聯(lián)用與MPC、MSW的規(guī)律，為臨床合理應(yīng)用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物與培養(yǎng)基LVX注射液（0.1 g/支，批號(hào)：18052631，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；注射用CFS（2.0 g/支，批號(hào)：16011507，深圳立健藥業(yè)有限公司）。M-H瓊脂平板培養(yǎng)基 （環(huán)凱微生物科技），M-H肉湯粉（英國(guó)Oxiod公司）。

1.2 菌株來(lái)源與鑒定選擇筆者所在醫(yī)院2017年1月—2017年 12月臨床標(biāo)本中分離的60株CRAB。鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606購(gòu)于中國(guó)食品藥品鑒定研究院；質(zhì)控菌為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922，均購(gòu)自濟(jì)南奧克賽生物技術(shù)有限公司。經(jīng)VITEK-2分析儀鑒定，采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取對(duì)亞胺培南或美羅培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌60株。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州杰博森儀器有限公司）；Vitek比濁儀 （法國(guó)生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振蕩器（江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司）；VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司）；DW-HL528型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）。

1.4 最低抑菌濃度的測(cè)定

1.4.1 單獨(dú)用藥時(shí)MIC的測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法，測(cè)定LVX和CFS單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的MIC，并按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2015 年標(biāo)準(zhǔn)［5］判讀結(jié)果。

1.4.2 測(cè)定LVX和CFS聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的MIC 采用簡(jiǎn)化棋盤法［6］測(cè)定LVX和CFS聯(lián)用時(shí)的MIC。

1.4.3 FIC指數(shù)的計(jì)算及判定標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。 判定標(biāo)準(zhǔn)：FIC 指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.5～1，相加作用；1～2，無(wú)關(guān)作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 MPC的測(cè)定

1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定抗菌藥物分別對(duì)質(zhì)控菌株和60株CRAB的MPC。LVX和CFS的藥物濃度范圍分別為0.125～512 mg/L和2～512 mg/L。每個(gè)濃度配制4個(gè)平板作為平行對(duì)照。

1.5.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以LVX和CFS的MIC、MPC為基準(zhǔn)，采用二倍稀釋法配制含兩藥混合的系列不同濃度梯度瓊脂平板。以LVX和CFS的單藥MIC為最低濃度，以LVX和CFS的單藥MPC為最高濃度，每個(gè)濃度4個(gè)平板。

1.5.3 菌懸液制備 從新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個(gè)菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，3000 r/min離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，3000 r/min離心棄上清，調(diào)整菌液濃度為3×1013CFU/L。

1.5.4 MPC的測(cè)定 取100μl 3×1013CFU/L菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個(gè)濃度4個(gè)平板。（35±2）℃培養(yǎng)72 h，以4個(gè)平板均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MPC。對(duì)含單藥瓊脂平板的測(cè)定為單藥MPC，對(duì)含兩藥瓊脂平板的測(cè)定即為聯(lián)合用藥后的MPC。對(duì)接近MPC篩選出來(lái)的菌株接種于無(wú)藥物的MH平皿，傳代兩次后，再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，取其平均值。計(jì)算選擇指數(shù)（selectiveity index，SI），SI=MPC/MIC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)；取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVX與CFS的聯(lián)用藥敏結(jié)果對(duì)60株臨床分離菌株，LVX與CFS聯(lián)用后，協(xié)同作用所占的比例為 0.50（30/60），相加所占的比例為 0.43（26/60），無(wú)關(guān)作用所占的比例為0.07（4/60），未見(jiàn)拮抗作用，以協(xié)同和相加作用為主。

2.2 抗菌藥物對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的 MIC、MPC、SI值LVX、CFS單用或聯(lián)用時(shí)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606的MIC、MPC、SI值見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，LVX和CFS聯(lián)合后，MIC分別由1.0 mg/L降為0.25 mg/L、2.0 mg/L降為0.5 mg/L；MPC分別由8.0 mg/L降為 1.0 mg/L、16.0 mg/L降為2.0 mg/L，MIC與MPC都有明顯降低。LVX的MSW 由 1.0～8.0 降為 0.25～1.0；CFS 的 MSW 由2.0～16.0降為0.5～2.0，兩者的MSW明顯縮小。

表1 LVX和CFS單用及聯(lián)用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC19606的 MIC、MPC、SI值（mg/L）

2.3 LVX和CFS對(duì)60株臨床分離菌株的MIC、MPC、SI值對(duì)60株臨床分離菌株，LVX的MIC范圍為 8～64 mg/L、MPC 范圍為 64～256 mg/L；CFS 的MIC 范圍為 8～32 mg/L、MPC 范圍為 128～256 mg/L。聯(lián)合用藥后，LVX的MIC范圍為 2～16 mg/L、MPC范圍為 8～64 mg/L；CFS 的 MIC 范圍為 4～16 mg/L、MPC范圍為64～128 mg/L，MIC與MPC都有顯著降低。聯(lián)合用藥后，LVX的MSW由8～128降為2～64；CFS的 MSW 由8～256降為 4～128，兩者的 MSW 明顯縮??；LVX、CFS單用對(duì)60株CRAB的SI分別為2～8、4～16；LVX、CFS 聯(lián)合使用 后兩 者對(duì) 60 株CRAB 的 SI分別為 2～32、4～16，與單獨(dú)用藥相比，SI值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLVX單用-聯(lián)合=0.000；PCFS單用-聯(lián)合=0.000）。結(jié)果顯示LVX聯(lián)合CFS顯著降低了MPC，縮小MSW，可以有效地防止耐藥突變菌株的產(chǎn)生。見(jiàn)表2。

表2 LVX和CFS單用及聯(lián)用對(duì)60株臨床分離菌株的MIC、MPC、SI值（mg/L）

3 討論

隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，由耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌所引發(fā)的臨床抗感染治療失敗及院內(nèi)感染的流行，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［8，9］。重癥感染患者病死率相對(duì)較高，已成為臨床治療的一大難題。

該研究結(jié)果顯示，LVX與CFS聯(lián)合應(yīng)用后，協(xié)同作用占50%，相加作用占43%，無(wú)關(guān)作用占7%，無(wú)拮抗作用，表明兩藥聯(lián)合可增強(qiáng)抑菌效果。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC19606和60株臨床分離菌株耐藥性研究顯示：LVX與CFS聯(lián)用后，均可降低其單用對(duì)CRAB的MPC，縮小耐藥突變選擇窗，說(shuō)明聯(lián)合用藥后可以有效地防止耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性的產(chǎn)生。

根據(jù)MIC理論用藥，僅可阻止大部分敏感菌的生長(zhǎng)，臨床一般的治療方案往往使藥物濃度落入MSW內(nèi)，引起耐藥突變菌富集擴(kuò)增。一旦富集擴(kuò)增的耐藥突變菌轉(zhuǎn)移到新宿主身上，就會(huì)成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，從而產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療失敗。MPC是一個(gè)反映抗菌藥物抗菌活性及藥物抑制耐藥突變株選擇能力的藥效學(xué)參數(shù)，與該藥物限制該種細(xì)菌耐藥突變株選擇的能力成反比例關(guān)系。Nordqvist等［7］報(bào)道了多黏菌單用及聯(lián)合利福平，可縮小其對(duì)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的MSW，防止多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株出現(xiàn)。單藥使用欲保持血藥濃度大部分時(shí)間維持在高于MPC的水平，勢(shì)必要增加給藥劑量，同時(shí)也增加了藥品不良反應(yīng)。

MSW理論為臨床合理用藥、防止耐藥菌產(chǎn)生提供了一種新思想，為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、有效提高臨床治愈率起到重要作用，也為控制耐藥菌在院內(nèi)傳播、降低發(fā)病率和病死率發(fā)揮了積極的作用。該研究對(duì)LVX與CFS聯(lián)用后治療CRAB感染進(jìn)行了初步探討，由于體內(nèi)藥物濃度不斷變化，影響因素較多，如何將體外研究結(jié)果應(yīng)用于體內(nèi)研究尚需進(jìn)一步探討。