血清E-cadherin、sE-cadherin水平與乳腺癌臨床分期及療效相關(guān)性分析

鐘 彪，鄒萌萌，李靄建，劉 揚

乳腺癌為一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其預(yù)后與腫瘤分期及治療方法、治療時機密切相關(guān)[1]。新輔助化療為局部晚期乳腺癌的一種規(guī)范療法，可縮小腫瘤體積，提高保乳手術(shù)成功率，在乳腺癌治療中具有重要作用[2]。但部分患者對新輔助化療敏感性較低，使其得到無效化療或低效化療，造成患者錯失最佳手術(shù)時機[3]。因此，探尋新輔助化療療效的預(yù)測指標(biāo)非常重要。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)為一種粘附分子，其表達(dá)減少或缺失可影響腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移，臨床研究也發(fā)現(xiàn)，E-cadherin表達(dá)水平與胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤的臨床分期、患者生存期有關(guān)[4]。而可溶性E-鈣粘蛋白(sE-cadherin)為E-cadherin裂解后產(chǎn)生的可溶性片段，在腫瘤患者血清、尿液等體液中均能檢出，且隨腫瘤細(xì)胞分化進(jìn)展，E-cadherin代謝加快，也能促進(jìn)血清sE-cadherin水平升高，故sE-cadherin在評估惡性腫瘤患者病情進(jìn)展中也具有一定作用[5]。然而，學(xué)術(shù)界對E-cadherin及sE-cadherin與乳腺癌化療效果的相關(guān)性研究較少。本研究回顧性分析行多西他賽+吡柔比星+環(huán)磷酰胺(Taxotere+Pirarubicin+Cyclophosphamide,TAC)方案化療乳腺癌患者臨床資料，探討患者E-cadherin、sE-cadherin水平與臨床分期、化療療效的相關(guān)性，為臨床預(yù)測新輔助化療療效及患者預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年5月—2017年9月成都大學(xué)附屬醫(yī)院行TAC方案化療的62例乳腺癌患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)空芯針穿刺活檢確診為乳腺癌；浸潤性乳腺癌；首次行乳腺癌治療；年齡18～70歲；臨床分期≥Ⅱ期；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受放化療、內(nèi)分泌治療等其他治療方案；合并其他惡性腫瘤；乳房組織炎癥、表皮潰瘍或皮膚性疾病；伴糖尿病、甲亢等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。62例乳腺癌患者均為女性；年齡42～64(53.69±10.36)歲；臨床分期Ⅱ期28例，Ⅲ期34例；浸潤性導(dǎo)管癌59例，浸潤性小葉癌3例。

1.2 化療方法 62例患者均行TAC化療方案：吡柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格10 mg，批準(zhǔn)文號H20045983)40～50 mg/m2，靜脈注射(iv)，1/d，21 d為1個周期；環(huán)磷酰胺(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格500 mg，批準(zhǔn)文號H20093393)500 mg/m2，iv，1/d，21 d為1個周期；多西他賽(北京協(xié)和藥廠，規(guī)格2 mL/80 mg，批準(zhǔn)文號H20093734)75 mg/m2，iv，2/d，21 d為1個周期；化療期間給予地塞米松防止水鈉潴留、昂丹司瓊止吐等基礎(chǔ)治療；化療后預(yù)防性使用粒細(xì)胞集落刺激因子，并檢查血象；所有患者在接受3個周期化療后，行手術(shù)治療。

1.3 療效評估方法 根據(jù)實體腫瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumour,RECIST)[6]分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、穩(wěn)定(stable disease,SD)、進(jìn)展(progressive disease,PD)共4個等級；其中CR為病灶完全消失，PR為腫瘤2個最大垂直直徑之和縮小>30%，SD為介于CR及PD間，PD為腫瘤2個最大垂直直徑之和增加>20%或出現(xiàn)新病灶。

1.4 E-cadherin測定與觀察 化療前穿刺活檢及化療后手術(shù)標(biāo)本均行常規(guī)石蠟切片及免疫組化分析。使用烤箱(60 ℃)烤片1 h；并使用二甲苯脫蠟2次(30 min/次)，100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇各3 min；使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次(3 min/次)，利用恒溫水浴(95 ℃、20 min)行抗原修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH為6.0)，接著使用PBS沖洗3次(3 min/次)；室溫下，使用3%過氧化氫阻斷10 min，滴加一抗(鼠抗人上皮性鈣粘附蛋白單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，在醫(yī)用冰箱(4 ℃)內(nèi)保存12 h；再次使用PBS沖洗3次(5 min/次)，滴加二抗(通用型抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，并在恒溫箱內(nèi)(37 ℃)孵育20 min；行PBS沖洗3次(5 min/次)，滴加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin，DBA)顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，顯微鏡下觀察染色情況；使用蘇木素復(fù)染2 min，并用1%鹽酸酒精分化，封片。操作中以PBS代替一抗作為陰性對照，使用已知陽性片為陽性對照片(陽性對照片由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)；在10×40高倍鏡視野下，由2名分析員獨立分析，隨機選取10個視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比記為0分(無)、1分(<25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)；并根據(jù)陽性細(xì)胞染色程度分為0分(無)、1分(淡黃)、2分(棕黃)、3分(棕褐)；2種分?jǐn)?shù)相加，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.5 sE-cadherin、糖類抗原153(carbohydrate antigen 153, CA153)測定 化療前及手術(shù)治療前抽取患者空腹肘外周靜脈血，離心保留上層血清，置于醫(yī)用冷凍儲藏設(shè)備(-80 ℃)待用；檢測前將其取出，在常溫下自然融化，使用酶聯(lián)免疫分析法(試劑由德國美天旎生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))檢測sE-cadherin濃度，血清sE-cadherin水平正常參考范圍為0～1 000 ng/mL；使用化學(xué)發(fā)光法(試劑由德國羅氏公司生產(chǎn))檢測血清CA153水平。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin水平與其病例特征的關(guān)系 62例乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)陽性51例。乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin水平在不同年齡、腫瘤直徑和雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)表達(dá)情況比較，差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者E-cadherin陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，而伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清sE-cadherin水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；見表1。

表1 乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin水平與其病例特征的關(guān)系

注：組內(nèi)比較，*P<0.05

2.2化療前后E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin、CA153水平 化療后，62例乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)較化療前下調(diào)(Z=3.234，P<0.05)，血清sE-cadherin水平較化療前升高(t=-5.811，P<0.05)，而CA153水平較化療前降低(t=17.593，P<0.05)，見表2。

表2 化療前后E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin、CA153水平

2.3 E-cadherin表達(dá)及sE-cadherin水平與CA153的相關(guān)性 經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗分析，發(fā)現(xiàn)化療前CA153水平與E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.356，P=0.019)；經(jīng)Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)化療前CA153水平與sE-cadherin水平呈正相關(guān)(r=0.412，P=0.008)。

2.4 臨床分期與化療前E-cadherin表達(dá)情況的相關(guān)性 不同臨床分期患者化療前E-cadherin表達(dá)強度差異顯著(Z=2.02，P<0.05)；且經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期與化療前E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.339，P<0.05)；見表3。

表3 臨床分期與化療前E-cadherin表達(dá)情況的相關(guān)性

2.5 化療療效與化療前E-cadherin表達(dá)情況的相關(guān)性 不同化療療效患者化療前E-cadherin表達(dá)強度差異顯著(Z=6.21，P<0.05)；且經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗分析，發(fā)現(xiàn)化療療效與化療前E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.297，P<0.05)；見表4。

表4 化療療效與化療前E-cadherin表達(dá)情況的相關(guān)性

注：62例患者中無PD者

2.6 臨床分期與化療前sE-cadherin水平的相關(guān)性 臨床分期Ⅱ期患者化療前sE-cadherin水平(2 154.65±254.69)低于Ⅲ期患者(2 299.65±249.54，t=2.256，P<0.05)；且經(jīng)Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期與化療前sE-cadherin水平呈正相關(guān)(r=0.394，P<0.05)。

2.7 化療療效與化療前sE-cadherin水平的相關(guān)性 不同化療療效患者化療前sE-cadherin水平差異顯著(F=4.162，P<0.05)；且經(jīng)Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)臨床分期與化療前sE-cadherin水平呈正相關(guān)(r=0.398，P<0.05)；見表5。

表5 化療療效與化療前sE-cadherin水平的相關(guān)性

3 討 論

目前，臨床常使用腫瘤直徑、臨床分期等病理學(xué)指標(biāo)評估腫瘤病情進(jìn)展?fàn)顩r，但隨著分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，E-cadherin在惡性腫瘤組織中表達(dá)的臨床意義受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在正常組織中E-cadherin可保持穩(wěn)定表達(dá)，可保護(hù)上皮形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，并誘導(dǎo)正常組織細(xì)胞接觸抑制，促使腫瘤細(xì)胞凋亡；但隨著乳腺癌等上皮來源腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)激活，上皮細(xì)胞膜上的E-cadherin表達(dá)下調(diào)，上皮細(xì)胞也轉(zhuǎn)化為具有移動特性的間質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[8]。故E-cadherin表達(dá)水平可作為早期乳腺癌的診斷指標(biāo)，且能輔助評估腫瘤的臨床分期及進(jìn)展。另外，sE-cadherin作為E-cadherin的胞外降解產(chǎn)物，且能參與腫瘤細(xì)胞分化、增殖的信號通路，有學(xué)者也提出，可將sE-cadherin作為癌癥輔助治療的靶標(biāo)，則sE-cadherin與腫瘤的分期及進(jìn)展有關(guān)[9]。然而，鮮有學(xué)者研究E-cadherin表達(dá)水平、sE-cadherin水平與化療療效的相關(guān)性。對此，本研究就乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)水平、sE-cadherin水平與其臨床分期及化療療效的相關(guān)性展開分析，以評估E-cadherin、sE-cadherin在評估乳腺癌病情進(jìn)展及預(yù)后的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者E-cadherin表達(dá)較化療前下調(diào)，而血清sE-cadherin水平較化療前升高。考慮此結(jié)果是由于新輔助化療能有效抑制乳腺癌細(xì)胞活性，而乳腺癌細(xì)胞主要來源于上皮細(xì)胞，使間質(zhì)細(xì)胞相對增多，造成存在于上皮細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)下調(diào)[10]；新輔助化療可刺激EMT活性，使E-cadherin代謝速度加快，而在下調(diào)E-cadherin的同時，增加血清sE-cadherin水平[11]。此外，臨床分期與化療前E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)，即化療前E-cadherin表達(dá)強度越低，臨床分期越高，與國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果一致[12]。這也證實，隨著乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖分化及病情進(jìn)展，上皮細(xì)胞中E-cadherin也逐漸缺失，造成E-cadherin表達(dá)下調(diào)。不僅如此，化療療效與化療前E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)，與外國學(xué)者研究結(jié)果不同[13]。推測此結(jié)果由以下因素作用引起：E-cadherin表達(dá)強度越低的乳腺癌患者腫瘤分期及惡性程度較高，對新輔助化療敏感性也較高，使其化療療效較好[14]。因此，E-cadherin表達(dá)強度較低的乳腺癌患者雖然臨床分期較高，但新輔助化療對其治療效果較好，利于患者預(yù)后。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者E-cadherin陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清sE-cadherin水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，這也提示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響機體E-cadherin表達(dá)的重要指標(biāo)?？紤]該結(jié)果與伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者腫瘤侵襲能力較強，惡性程度較高，E-cadherin表達(dá)強度低有關(guān)。另外，本研究也就經(jīng)典乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA153水平與其相關(guān)性展開分析，發(fā)現(xiàn)化療前CA153水平與E-cadherin表達(dá)強度呈負(fù)相關(guān)，與sE-cadherin水平呈正相關(guān)。也初步證實，乳腺癌惡性程度與E-cadherin表達(dá)強度和血清sE-cadherin水平具有顯著相關(guān)性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期與化療前sE-cadherin水平呈正相關(guān)，這也說明sE-cadherin水平能隨乳腺癌患者病情進(jìn)展、E-cadherin表達(dá)下調(diào)而逐漸升高。也有學(xué)者對此指出，sE-cadherin作為一種血清學(xué)檢測指標(biāo)，具有檢測方便的優(yōu)勢，可輔助乳腺癌早期診斷[15]。但臨床分期與化療前sE-cadherin水平呈正相關(guān)，即化療前sE-cadherin水平越高，新輔助化療效果越好。這可能與腫瘤分期及惡性程度越高的腫瘤細(xì)胞，對新輔助化療敏感性也越高，使其化療效果提高有關(guān)。故臨床在根據(jù)化療前sE-cadherin水平評估乳腺癌患者病情進(jìn)展，并預(yù)測患者新輔助化療療效時，應(yīng)結(jié)合其他指標(biāo)共同觀察，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，化療前E-cadherin表達(dá)情況與乳腺癌患者臨床分期及新輔助化療效果呈負(fù)相關(guān)，而血清sE-cadherin水平則與患者臨床分期及化療效果呈顯著正相關(guān)，臨床可結(jié)合E-cadherin表達(dá)情況及sE-cadherin水平評估患者病情進(jìn)展，并預(yù)測新輔助化療對其敏感性，以判斷新輔助化療的可行性，為患者提供最佳治療方案。本研究為回顧性研究，具有一定的局限性，還需要多中心、大樣本、前瞻性、隨機對照研究來進(jìn)一步證實研究結(jié)論。