PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性和環(huán)境交互作用與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究

章 婷 徐 琦

最新數(shù)據(jù)顯示，2011 年估計(jì)有310,244 例新診斷為結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的病例，占所有新診斷癌癥病例的9.20%[1]。因此，結(jié)直腸癌正在成為民眾生命健康的主要威脅。CRC 是一種由生活方式、營(yíng)養(yǎng)、身體活動(dòng)等環(huán)境因素和遺傳因素等共同導(dǎo)致的疾病[2-4]。根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），配對(duì)樣同源域1（PITX1）遺傳多態(tài)性已被新確定為特異于東亞人的CRC 敏感遺傳因子[5]。目前，PITX1 基因多態(tài)性及其與環(huán)境的相互作用對(duì)CRC 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響還缺少相關(guān)研究。PITX1 rs647161 位于5q31.1 區(qū)的5 號(hào)染色體上，其中一組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與CRC 發(fā)生有關(guān)[6]。在該區(qū)域的基因中，PITX1 最接近rs647161（上游約129kb）[7]。PITX1 在CRC 致癌過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是腫瘤抑制基因[8]。本研究采用病例對(duì)照研究的形式分析PITX1基因rs647161 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與CRC 易感性及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年12 月期間杭州市富陽(yáng)區(qū)第二人民醫(yī)院和浙江省腫瘤醫(yī)院收治的CRC 患者120 例作為研究組，所有患者均接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療，并能夠取得組織進(jìn)行病理診斷。TNM 分期：I 期22 例，II 期23 例，III 期35 例，IV 期40 例。根據(jù)研究組患者年齡、性別匹配在醫(yī)院體檢中心招募120 名健康體檢者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均經(jīng)臨床確診后通過(guò)組織病理學(xué)證實(shí)為CRC[9]；（2）功能狀態(tài)評(píng)分≥60 分[10]，（3）具有明顯可測(cè)量的病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝腎功能異常；（2）由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任醫(yī)師共同判定認(rèn)為預(yù)計(jì)生存期＜6 個(gè)月；（3）對(duì)化療藥物不耐受。

表1 結(jié)直腸癌患者與健康體檢者一般資料比較（

表1 結(jié)直腸癌患者與健康體檢者一般資料比較（

注：BMI：身體質(zhì)量指數(shù)；研究組：結(jié)直腸癌患者；對(duì)照組：健康體檢者

組別研究組對(duì)照組t/χ2 值P 值例數(shù)120 120年齡（歲）57.54±10.11 58.43±12.32 0.61 0.54男性[n（%）]80（66.67）84（70.00）0.31 0.58 BMI（kg/m2）23.42±2.76 24.14±3.01 1.87 0.06吸煙[n（%）]34（28.33）32（26.67）0.08 0.77飲酒[n（%）]43（35.83）40（33.33）0.17 0.68家族史[n（%）]11（9.17）3（2.50）4.85 0.03

1.3 方 法 取受試者靜脈血約3mL，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號(hào)DP318-02，批號(hào)2014051306）提取基因組DNA，使用primer premier 5.0 設(shè)計(jì)rs647161 位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增引物序列為上游：5’-GAAGGACCTGTGGTTGGTG A-3’；下游：5’-GGCTTGAAACCTCTACCTGGG-3’。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成后稀釋成10pmol 的工作液。PCR 反應(yīng)的體系為：DNA 模板50ng，2.5μL 10×buffer，1.5μL 25mM Mg2+，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL 5U Taq 酶，10pmol 的上下游引物各0.5μL，用水補(bǔ)足25μL。PCR 后直接將PCR 產(chǎn)物寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，正反方向測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PITX1 rs647161 位點(diǎn)各基因型測(cè)序結(jié)果

1.4 臨床參數(shù)收集 收集所有受試者的年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙狀況、飲酒狀況、CRC 家族史以及CRC 患者的TNM 分期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS20.0 軟件，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)[n（%）]表示，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料的表示方法為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s） ，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t 檢驗(yàn)，基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗(yàn)。采用非條件Logistic 回歸模型估計(jì)優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 研究組和對(duì)照組年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組患者有CRC 家族史的比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.85，P=0.03），見(jiàn)表1。

2.2 PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性 PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究組和對(duì)照組PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.70，P=0.02）。以野生型為參考，兩組雜合子（CA）基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.04，95%CI=0.56～1.93，P=0.91），純合子（AA）是CRC 的危險(xiǎn)因素（OR=2.78，95%CI=1.22～6.39，P=0.01）。研究組A 等位基因頻率顯著高于對(duì)照組（χ2=6.99，P=0.01），A 等位基因是CRC 的高風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=1.69，95%CI=1.12～2.53，P=0.01），見(jiàn)表2。

表2 結(jié)直腸癌患者與健康體檢者PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

2.3 PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性和環(huán)境因素交互作用與CRC 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性 在男性攜帶A 等位基因患CRC 風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著升高（OR=1.11，95%CI=0.58～2.16，P=0.73），女性攜帶A 等位基因患CRC 風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=3.70，95%CI=1.13～12.57，P=0.01）。在年齡＜50 歲的A 等位基因攜帶者CRC 風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著升高（OR=0.89，95%CI=0.41～1.91，P=0.74），而年齡≥50 歲的A 等位基因攜帶者CRC 風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=2.61，95%CI=1.13～6.04，P=0.01）。BMI＜25kg/m2的A 等位基因攜帶者沒(méi)有CRC 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.87，95%CI=0.45～1.68，P=0.66），而B(niǎo)MI≥25kg/m2的受試者攜帶A 等位基因時(shí)CRC 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=5.33，95%CI=1.58～18.83，P＜0.01）。吸煙的A 等位基因攜帶者具有較高的CRC 患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=4.33，95%CI=1.09～18.60，P=0.02），而不吸煙的A 等位基因攜帶者患CRC 風(fēng)險(xiǎn)并未顯著升高（OR=1.16，95%CI=0.61～2.20，P=0.64）。飲酒的A 等位基因攜帶者具有較高的CRC 患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=4.49，95%CI=1.41～14.88，P＜0.01），而不飲酒的A 等位基因攜帶者患CRC 風(fēng)險(xiǎn)并未顯著升高（OR=0.98，95%CI=0.50～1.94，P=0.96）。有CRC 家族史和沒(méi)有CRC 家族史的A 等位基因攜帶者患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)均沒(méi)有顯著升 高（OR=0.27，95%CI=0.02 ～3.06，P=0.20；OR=1.27，95%CI=0.73～2.22，P=0.37），見(jiàn)表3。

2.4 PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 嚴(yán)重程度相關(guān)性 以野生型（CC）為參考，雜合子（CA）和純合子（AA）的CRC 患者TNM 分期在III 期和IV 期的比例顯著高于I 期和II 期（OR=3.42，95%CI=1.25～9.57，P=0.01；OR=7.39，95%CI=2.06～28.94，P＜0.01），見(jiàn)表4。

3 討 論

CRC 是我國(guó)乃至世界上許多其它地區(qū)最常診斷的惡性腫瘤之一[11]。近年來(lái)分子生物學(xué)和癌癥遺傳學(xué)的創(chuàng)新提高了對(duì)散發(fā)性和遺傳性CRC 發(fā)病機(jī)制的理解[12-14]。用于分析基因組的復(fù)雜分子技術(shù)的發(fā)展使得能夠鑒定涉及CRC 發(fā)病機(jī)理的若干遺傳改變。

PITX1 是一種與bicoid 相關(guān)的同源域因子，是一種已知的轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育中的垂體前葉腺中表達(dá)[15]。研究顯示，PITX1 基因是一個(gè)抑癌基因，與CRC 的發(fā)展關(guān)系密切[8]。在研究PITX1 基因遺傳變異時(shí)發(fā)現(xiàn)rs647161 位點(diǎn)多態(tài)性是疾病發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，目前其功能尚未明確，該位點(diǎn)也不存在與任何已知的轉(zhuǎn)錄或者調(diào)解序列中[8]。雖然rs647161 具有不明確的功能，但全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS） 顯示，rs647161 位點(diǎn)SNP 與CRC 發(fā)生具有一定聯(lián)系[16-17]。PITX1 和該家族的其他成員參與胚胎發(fā)育[18]。此外，這些基因控制成熟組織的分化和增殖，并可作為腫瘤抑制基因在致癌過(guò)程中起到因果作用[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組患者中有CRC 家族史的比例顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明CRC 家族史是CRC 的危險(xiǎn)因素，與聶泓宇等[20]研究結(jié)果一致。分析結(jié)果顯示，研究組和對(duì)照組PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因型頻率之間的差異顯著，AA 基因型患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)相比CC 基因型提高2.78 倍，A 等位基因攜帶者患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)比C 等位基因高1.69 倍。從本研究結(jié)果可以看出，rs647161 位點(diǎn)基因檢測(cè)可能對(duì)于臨床上CRC 的預(yù)防具有重要意義。CRC 是遺傳因素與環(huán)境因素共同決定的結(jié)果，因此本研究同時(shí)還分析了rs647161 位點(diǎn)與環(huán)境因素相互作用的情況，結(jié)果顯示在男性、年齡＜50 歲、BMI＜25kg/m2、不吸煙、不飲酒這幾類(lèi)人群中rs647161位點(diǎn)A 等位基因攜帶者患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)并沒(méi)有顯著提高，相反在女性、年齡≥50 歲、BMI≥25kg/m2、吸煙、飲酒這幾類(lèi)人群中A 等位基因攜帶者患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于C 等位基因攜帶者，提示rs647161 位點(diǎn)與年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒等因素之間存在相互作用影響CRC 患病風(fēng)險(xiǎn)。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在有CRC 家族史和沒(méi)有CRC 家族史受試者中A 等位基因攜帶者患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)并沒(méi)有顯著差異，由此說(shuō)明rs647161 位點(diǎn)與CRC 家族史之間并沒(méi)有顯著相互作用。然而，由于本研究樣本量有限，該研究發(fā)現(xiàn)可能還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

表3 不同臨床參數(shù)組PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析

表4 PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與TNM 分期之間的相關(guān)性

另外，本研究還分析了rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 患者疾病進(jìn)展情況，我們主要是通過(guò)分析rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 患者TNM 分期之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示雜合子（CA）相比野生型疾病進(jìn)展為III/IV 的風(fēng)險(xiǎn)升高了3.42 倍，純合子（AA）相比野生型疾病進(jìn)展為III/IV 的風(fēng)險(xiǎn)升高了7.39 倍，由此說(shuō)明rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 患者疾病進(jìn)展顯著相關(guān)。盡管目前這些研究結(jié)果的具體機(jī)制并不清楚，但是該研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于我們更好的理解癌癥的病因?qū)W和預(yù)測(cè)癌癥風(fēng)險(xiǎn)并采取預(yù)防措施具有積極的意義。

綜上所述，PITX1 rs647161 位點(diǎn)基因多態(tài)性與CRC 風(fēng)險(xiǎn)和疾病進(jìn)展有關(guān)，A 等位基因和性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素的交互作用增加患CRC的風(fēng)險(xiǎn)，為了更好的預(yù)測(cè)和預(yù)防CRC 的發(fā)生，可能需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。