不同產(chǎn)地益母草種質(zhì)HPLC 指紋圖譜分析

邵璐彬 徐建中 羅頁思 孫乙銘 王志安

益母草（Leonurus japonicus Houtt）為唇形科一年生或二年生草本植物，具有調(diào)經(jīng)，行血生血、祛瘀、消水、安胎等功效，是中醫(yī)治療婦科疾病運(yùn)用廣泛的中藥之一，也是婦科要藥。益母草藥材的主要有效成分是生物堿類，主要為益母草堿（leonurine）、水蘇堿（stachydrine）、和益母草啶（leonuridine）、益母草寧（leonurinine）等，在各生物堿中，以水蘇堿含量較高，其次是益母草堿[1]。由于益母草傳統(tǒng)采收是在花前期，此時益母草堿等生物堿含量非常低，基本上不符合藥典規(guī)定[2]。而當(dāng)年播種當(dāng)年采收的益母草，均不發(fā)生抽苔，植株呈“芥菜”型，莖極短，葉片數(shù)多，由于益母草生物堿含量主要集中在葉片中，因此植株益母草堿等生物堿含量高，而且不同產(chǎn)地的益母草生物堿成分含量差異較大。本試驗主要通過HPLC 色譜指紋圖譜技術(shù)分析評價不同產(chǎn)地的益母草在生物堿類成分方面的差異性，為益母草優(yōu)良品種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

Aglient HP1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；二極管陣列檢測器（DAD）（美國安捷倫公司）；AB204-S 型電子天平（Mettler Toledo 公司）；C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）（北京迪科馬科技有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）。鹽酸益母草堿對照品111823-201303（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（杭州化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純）（默克股份有限公司）；甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）。

供試材料益母草種子來源（見表1），將各益母草種質(zhì)統(tǒng)一種植在浙江省義烏市和溪村益母草種質(zhì)資源圃，經(jīng)浙江省中藥研究所徐建中高級工程師鑒定為益母草，取營養(yǎng)生長期未開花鮮益母草，70℃烘干，粉碎（過三號篩）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18 柱（250mm×4.6mm，5μm），北京迪科馬科技有限公司提供；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：277nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；流動相：乙腈-0.1%甲酸；流動相梯度洗脫比例見表2。

表2 梯度洗脫流動相比例

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的鹽酸益母草堿對照品0.0035g，置10mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再取1mL 置10mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成每1mL 含35μg 的溶液，作為對照品溶液。對照品色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（鹽酸益母草堿）

2.3 供試品溶液制備 精密稱取約1g 益母草藥材粉末（過三號篩）置具塞平底燒瓶中，精密加入50mL水，稱定重量，加熱回流3h，補(bǔ)重過濾，精密量取20mL 濾液至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取4 次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 色譜指紋峰的標(biāo)定 以參照物鹽酸益母草堿對應(yīng)的色譜峰的保留時間和峰面積為1，計算其他各色譜指紋峰的相對保留時間及相對峰面積[3]。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一益母草樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按“2.1”項的方法進(jìn)樣，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結(jié)果表明共有峰相對保留時間的RSD 在0.31%～1.0%之間，相對峰面積的RSD 在0.78%～2.33%之間，均＜5%，表明實驗儀器精密度良好。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一益母草樣品6份，按“2.3”項方法制備供試品，按“2.1”項的方法進(jìn)樣，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結(jié)果表明共有峰的相對保留時間的RSD 在0.18%～0.62%之間，相對峰面積的RSD 在1.12%～2.45%之間，均＜5%，表明該實驗方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一益母草樣品溶液，室溫下放置，在2、4、6、12、24h 按“2.1”項的方法進(jìn)樣測定，考察各峰相對保留時間、相對峰面積及RSD 值。結(jié)果表明共有峰相對保留時間的RSD 在0.18%～0.62%之間，相對峰面積的RSD 在1.13%～2.81%之間，均＜5%，表明供試品溶液24h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 共有指紋峰的標(biāo)定 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”對每個品種的指紋圖譜進(jìn)行分析，得到指紋圖譜[4]以及共有模式指紋圖譜，見圖2、圖3。

通過對15 個種質(zhì)的指紋圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的益母草存在差異，如圖2 所示，15 個樣品一共有24 個共有峰，峰匹配數(shù)達(dá)10 個以上樣品的峰有38 個，其中吉林通化在108min 左右有較強(qiáng)吸收峰，其余種質(zhì)在該處幾乎沒有吸收峰，另外，各品種共有峰面積差異也較顯著。

圖2 不同品種益母草HPLC 指紋圖譜

圖3 益母草共有模式指紋圖譜

2.4.6 相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用多點(diǎn)校正將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜。將其他樣品的色譜峰與對照圖譜進(jìn)行自動匹配，計算S1～S15 樣品與對照圖譜的相似度，結(jié)果表明益母草各種質(zhì)相似度較高，都在0.92 以上，見表3。

2.4.7 聚類分析 在Aglient 色譜工作站中將指紋圖譜的所有峰進(jìn)行自動積分，以峰面積為聚類依據(jù)，用SPSS 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類統(tǒng)計分析，得到聚類結(jié)果，見圖4。

如圖4 所示，聚類分析結(jié)果將15 個種質(zhì)資源分為四類，第1 類包括9 個種質(zhì)（湖北孝感、浙江義烏、浙江衢州B、湖南桂東、浙江寧海、吉林通化、江西修水、浙江白龍橋、山東臨朐）；第2 類包括2 個種質(zhì)（河南南陽、河南靈寶）；第3 類包括3 個種質(zhì)（浙江衢州A、廣西桂林、河南社旗），第4 類為云南陸良種質(zhì)。

表3 益母草指紋圖譜相似度

圖4 不同益母草品種指紋圖譜聚類分析結(jié)果

2.4.8 主成分分析 在Aglient 色譜工作站中將指紋圖譜的所有峰進(jìn)行自動積分，以峰面積為聚類依據(jù)，用SPSS 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 統(tǒng)計分析，得到主成分分析圖，見圖5。主成分分析的結(jié)果基本與聚類分析結(jié)果一致，浙江衢州A、廣西桂林與河南社旗三個種質(zhì)可以看作一個區(qū)，河南南陽與河南靈寶可以看作一個區(qū)，吉林通化與江西修水可以看作一個區(qū)，云南陸良與浙江義烏等種質(zhì)相對其他地區(qū)稍遠(yuǎn)，可以看作單獨(dú)分類。

3 討 論

圖5 主成分分析圖

3.1 提取方法的考察 本實驗曾對比研究了水提醇沉法、水提法-過柱純化法、水提法-有機(jī)溶劑萃取法等方法。過柱純化法選擇強(qiáng)酸性陽離子樹脂[5]為交換樹脂，有機(jī)溶劑萃取分別選擇氯仿、乙酸乙酯、正己烷三種不同溶劑萃取，將得到的色譜圖結(jié)果與對照品圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果顯示過柱純化法與乙酸乙酯萃取法，均能提取出鹽酸益母草堿，考慮到實驗操作步驟及時間，確定以水提法-乙酸乙酯萃取法為適宜提取方法。

3.2 提取時間和萃取次數(shù)的考察 曾分別試驗了加熱回流時間為1、2、3、4h，并分別用乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾、進(jìn)樣。結(jié)果顯示：隨著提取時間延長，藥材中提取的有效成分含量越高，提取3h 與提取4h的含量無較大差異，因此確定回流提取時間為3h。回流后曾試驗用乙酸乙酯萃取2、3、4、5 次，收集乙酸乙酯層蒸干，再用70%乙醇定容至10mL，過濾、進(jìn)樣，結(jié)果顯示：萃取4 次，測得的含量已基本穩(wěn)定，因此確定萃取次數(shù)為4 次。關(guān)于萃取：在利用乙酸乙酯萃取時，溶液乳化程度較高，可能是實驗環(huán)境溫度過低，嘗試對萃取比例進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸乙酯：水溶液=2:1 時，乳化程度大大減弱。

3.3 色譜條件考察 曾分別試驗了237、257、277 和297nm 等四種波長進(jìn)行測定，結(jié)果表明277nm 波長測定時具有較好的紫外吸收和豐富的色譜峰信息，因此確定了以277nm 作為檢測波長。還分別考察了20℃、25℃、30℃柱溫下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)25℃與30℃色譜峰分離效果較好且無明顯差別，考慮柱子因素，確定柱溫為30℃。另外，還分別試驗了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸等為流動相，結(jié)果表明以乙腈-0.1%甲酸梯度系統(tǒng)時各色譜峰分離較好，通過試驗確定了適宜的梯度洗脫程序。

3.4 益母草主要有效成分為生物堿類，有文獻(xiàn)表明受到物候、光照強(qiáng)度和土壤水分的影響，不同產(chǎn)地益母草藥材生物堿類成分含量會有所差異[6-8]。本實驗建立了益母草中生物堿類等成分的高效液相色譜指紋圖譜，并將15 個不同產(chǎn)地的益母草進(jìn)行比較，通過實驗分析發(fā)現(xiàn)，各種質(zhì)之間化學(xué)成分種類相似度較高，說明益母草藥材的化學(xué)成分種類基本一致；而化學(xué)成分含量差異較大，可能是種質(zhì)之間有差異。

3.5 指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段[9]。目前對益母草高效液相指紋圖譜的研究，多數(shù)集中在益母草注射液及益母草膠囊，且多為鹽酸水蘇堿指紋圖譜[10-11]。鐘寧遠(yuǎn)等[11]利用高效液相色譜法建立了益母草流浸膏指紋圖譜，得到6 個共有峰，為綜合評價和控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。本實驗通過考察采集于浙江義烏種質(zhì)資源圃的15 份不同種源益母草藥材，構(gòu)建益母草中鹽酸益母草堿高效液相指紋圖譜及其共有模式圖譜，得到共有峰24 個，可評價益母草藥材內(nèi)在質(zhì)量及品種的特異性，從而為其資源的現(xiàn)代化開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。