低強(qiáng)度超聲對大鼠多烯紫杉醇化療所致骨髓抑制的影響及其機(jī)制

汪 威，劉寶茹，陳俊林，羅 東，王 嫣

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

化療是治療惡性腫瘤的常用方法，但同時(shí)會引發(fā)諸多不良反應(yīng)。化療所致白細(xì)胞減少癥、尤其是中性粒細(xì)胞減少癥是常見的劑量限制性毒性反應(yīng)[1-2]。目前臨床廣泛應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)應(yīng)對化療引起的中性粒細(xì)胞減少[3]，可引發(fā)骨痛、疲勞和發(fā)熱等[4]。低強(qiáng)度超聲用于治療細(xì)胞周期特異性藥物阿糖胞苷(作用于S期)及細(xì)胞周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的白細(xì)胞減少癥效果顯著，可使外周血白細(xì)胞數(shù)量增加，恢復(fù)骨髓造血功能[5-7]，且輻照局部皮膚和肌肉組織無明顯損傷[8-9]。本研究采用細(xì)胞周期特異性藥物多烯紫杉醇建立大鼠白細(xì)胞減少癥模型，觀察低強(qiáng)度超聲可否減輕化療所致骨髓抑制，恢復(fù)骨髓造血功能，并分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級別雌性SD大鼠[重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXK(渝)2017-0023]40只，體質(zhì)量120～150 g，于25℃～28℃、相對濕度40%～55%環(huán)境下飼養(yǎng)1周，12 h晝夜交替，自由飲食、飲水。隨機(jī)均分為超聲組及對照組，每組20只。

1.2 化療方法 腹腔注射多烯紫杉醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，劑量25 mg/kg體質(zhì)量，持續(xù)4天。

1.3 低強(qiáng)度超聲治療 采用海扶動物實(shí)驗(yàn)專用低強(qiáng)度超聲治療儀，于第1次多烯紫杉醇注射后當(dāng)日開始。將探頭置于大鼠右側(cè)股骨干骺端，對超聲組每日輻照1次(每次20 min)，持續(xù)7日，參數(shù)：聲強(qiáng)200 mW/cm2，頻率0.3 MHz，重復(fù)頻率1 kHz，占空比20%；對照組同期予以假照(探頭無能量輸出)。

1.4 血常規(guī)檢查 于多烯紫杉醇注射前、超聲輻照開始后第4、7及14天，經(jīng)大鼠眼眶取血1 ml，采用Sysmex XT-2000i全自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀行血常規(guī)檢查，記錄白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 免疫球蛋白檢測 于多烯紫杉醇注射前、超聲輻照開始后第4、7及14天，分別經(jīng)大鼠眼眶取血2 ml，以 3 000 r/min離心10 min，取上清，采用ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測免疫球蛋白A(immunoglobulin A， IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G， IgG)及免疫球蛋白M(immunoglobulin M， IgM)表達(dá)水平。

1.6 干細(xì)胞因子(stem cell factor， SCF)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)檢測 于超聲輻照開始后第4天，2組各隨機(jī)選取4只大鼠處死，在無菌環(huán)境下完整剝離大鼠右側(cè)整段股骨，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗大鼠股骨骨髓，將沖洗后的液體以3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，采用RT-qPCR法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本重復(fù)測量3次，以2-△△Ct法計(jì)算ICAM-1、VCAM-1基因信使核糖核酸(mRNA)相對表達(dá)水平，引物的正、反向核苷酸序列見表1。

1.7 組織學(xué)觀察 于多烯紫杉醇注射前、超聲輻照開始后第4、7及14天，對2組分別隨機(jī)選取3只大鼠處死，將其右側(cè)股骨用于組織學(xué)觀察。于超聲輻照開始后第7天對2組處死后的大鼠超聲輻照處皮膚和肌肉組織取材。將離體標(biāo)本均置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，石蠟包埋、切片，HE染色后，采用Olympus XI-70光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。采用Image J計(jì)數(shù)軟件計(jì)數(shù)大鼠骨髓組織中的有核細(xì)胞，每個(gè)樣本重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

開始注射多烯紫杉醇后，大鼠均出現(xiàn)不同程度食物和水?dāng)z入量減少、活動減少，身體蜷縮。超聲組分別于注射第1、3天各死亡2只，對照組分別于注射第2、3天各死亡2只。

2.1 血常規(guī) 2組大鼠不同時(shí)間外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果見表2。

2.2 免疫球蛋白 2組大鼠不同時(shí)間免疫球蛋白檢測結(jié)果見表3。

2.3 SCF、ICAM-1及VCAM-1 超聲輻照開始后第4天，超聲組骨髓SCF及ICAM-1 mRNA相對表達(dá)水平分別為2.34±0.11及1.86±0.10，對照組分別為1.00±0.07及1.00±0.12，超聲組SCF(t=17.272，P<0.001)及ICAM-1(t=9.550，P=0.001)表達(dá)水平均明顯高于對照組；超聲組VCAM-1 mRNA相對表達(dá)水平為0.37±0.02，與對照組相比明顯降低(1.00±0.09；t=11.940，P<0.001)。

表1 RT-qPCR檢測引物的正、反向核苷酸序列

表2 2組不同時(shí)間點(diǎn)血常規(guī)檢查結(jié)果(×109/L，±s)

表2 2組不同時(shí)間點(diǎn)血常規(guī)檢查結(jié)果(×109/L，±s)

組別白細(xì)胞多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組5.06±1.3711.17±2.8111.79±3.9313.88±3.958.5130.003對照組6.59±1.493.25±2.518.48±1.8913.65±2.3818.550<0.001t值1.8513.9361.4490.103——P值0.0940.0110.1940.921——組別中性粒細(xì)胞多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組0.58±0.352.3±0.813.49±0.864.37±1.1214.990<0.001對照組1.00±0.200.20±0.022.21±0.474.69±0.28101.200<0.001t值2.0773.4702.5600.475——P值0.0830.0400.0510.660——組別淋巴細(xì)胞多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組3.09±0.684.98±1.417.09±0.826.73±0.5314.560<0.001對照組3.17±0.950.70±0.195.49±1.135.42±1.1212.8000.001t值0.1414.0402.0601.784——P值0.8930.0270.0940.149——

注：2組多烯紫杉醇注射前、超聲輻照第4、7及14天樣本量均為20、16、9及6只

2.4 骨髓組織表現(xiàn) 超聲輻照開始后第4天，2組骨髓組織有核細(xì)胞較多烯紫杉醇注射前明顯減少，脂肪成分較多，但在第7、14天有核細(xì)胞逐漸增多，脂肪成分逐漸減少，見圖1。

與對照組比較，超聲輻照開始后第4(t=10.416，P<0.001)、7天(t=4.285，P=0.005)超聲組大鼠骨髓有核細(xì)胞均明顯增多，見表4。

2.5 皮膚和肌肉組織表現(xiàn) 超聲輻照開始后第7天，2組大鼠輻照處表皮及真皮均未見明顯異常，見圖2；肌肉組織未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，見圖3。

3 討論

本研究應(yīng)用多烯紫杉醇建立大鼠白細(xì)胞減少癥模型，以低強(qiáng)度超聲治療化療所致骨髓抑制，發(fā)現(xiàn)超聲輻照開始后第4天2組外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。相對于多烯紫杉醇注射前，對照組上述指標(biāo)于超聲假照第4天呈明顯下降趨勢,而在第7、14天表現(xiàn)出持續(xù)升高趨勢，考慮為機(jī)體對化療藥物所致骨髓抑制的自身恢復(fù)過程；而超聲組外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)在超聲輻照開始后第4天即增高，且在第7、14天保持升高趨勢，分析原因，可能在于本研究以化療與超聲輻照同時(shí)進(jìn)行的方法縮短了化療后白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時(shí)間，超聲輻照通過增加外周血中白細(xì)胞的數(shù)量而增強(qiáng)了化療后大鼠的免疫力和抗感染能力。低強(qiáng)度超聲主要影響外周血中白細(xì)胞的數(shù)量，而對紅細(xì)胞和血小板的影響較小，可能由于白細(xì)胞的細(xì)胞周期短，化療后白細(xì)胞下降最快。

檢測免疫球蛋白水平，發(fā)現(xiàn)超聲組在輻照開始后第7、14天IgA水平較對照組顯著升高(P均<0.05)，第4、14天IgG、IgM水平較對照組顯著升高(P均<0.05)，提示低強(qiáng)度超聲可有效提高化療后大鼠血清免疫球蛋白水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

骨髓造血微環(huán)境由骨髓微循環(huán)、間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子組成[10]，化療可通過損傷基質(zhì)細(xì)胞引起造血功能障礙[11]。SCF是早期造血干細(xì)胞存活、增殖和分化的關(guān)鍵[12]。本研究超聲輻照開始第4天，超聲組SCF mRNA相對表達(dá)水平較對照組顯著升高，表明SCF促進(jìn)了骨髓造血干細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)骨髓造血功能恢復(fù)。ICAM-1和VCAM-1是骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的2種黏附分子。ICAM-1可增強(qiáng)造血細(xì)胞對細(xì)胞因子的敏感性并參與造血調(diào)節(jié)[13]；VCAM-1可介導(dǎo)干細(xì)胞動員，在骨髓細(xì)胞的定位、增殖和分化中的作用不可替代[14-15]。超聲輻照開始第4天，超聲組ICAM-1 mRNA相對表達(dá)水平較對照組顯著升高，且VCAM-1 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低，表明低強(qiáng)度超聲輻照通過調(diào)節(jié)ICAM-1及VCAM-1而促進(jìn)了骨髓造血細(xì)胞分裂、增殖和向外周血釋放，增加白細(xì)胞數(shù)量，改善骨髓抑制。

表3 2組不同時(shí)間點(diǎn)血清免疫球蛋白檢測(±s)

表3 2組不同時(shí)間點(diǎn)血清免疫球蛋白檢測(±s)

組別IgA(μg/ml)多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組2.25±0.591.96±0.201.02±0.052.38±0.3112.6700.002對照組2.05±0.461.86±0.450.83±0.091.15±0.167.8630.009t值0.4630.3523.1966.107——P值0.6670.7430.0330.004——組別IgG(mg/ml)多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組16.07±4.3014.97±1.529.43±1.3719.84±1.878.4930.007對照組18.68±5.089.47±0.559.19±1.1212.92±0.208.5370.007t值0.7846.8060.2717.340——P值0.463<0.0010.795<0.001——組別IgM(μg/ml)多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天F值P值超聲組999.48±203.811 107.38±182.42537.79±81.761 301.09±373.065.7110.022對照組1 075.84±319.27793.97±151.05465.83±38.86723.21±91.525.6060.023t值0.4032.6471.5903.009——P值0.7010.0380.1630.024——

注：2組多烯紫杉醇注射前、超聲輻照第4、7及14天樣本量均為20、16、9及6只

表4 2組不同時(shí)間點(diǎn)骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)，±s)

表4 2組不同時(shí)間點(diǎn)骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)，±s)

組別多烯紫杉醇注射前超聲輻照開始后第4天超聲輻照開始后第7天超聲輻照開始后第14天超聲組2 128±751 810±461 999±842 650±112對照組2 111±1071 230±1021 794±452 588±67t值0.25610.4164.2850.955P值0.806<0.0010.0050.377

注：每組不同時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)選取3只大鼠，每只分別測量3次

圖1不同時(shí)間骨髓組織病理圖(HE，×200) A～D.對照組多烯紫杉醇注射前(A)、超聲輻照第4天(B)、輻照第7天(C)、輻照第14天(D)； E～H.超聲組多烯紫杉醇注射前(E)、超聲輻照第4天(F)、輻照第7天(G)、輻照第14天(H)

此外，本研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲輻照不僅可通過改善骨髓造血微環(huán)境、增加骨髓有核細(xì)胞數(shù)量來恢復(fù)骨髓造血功能，且對輻照局部皮膚和肌肉無明顯損傷。

綜上所述，本研究應(yīng)用化療藥物多烯紫杉醇建立白細(xì)胞減少癥模型，以低強(qiáng)度超聲輻照有效改善化療所致骨髓抑制，恢復(fù)骨髓的造血功能。本研究的主要不足：①采用單藥化療，而臨床治療惡性腫瘤多采用聯(lián)合化療；②低強(qiáng)度超聲用于治療化療后骨髓抑制的參數(shù)、評價(jià)指標(biāo)及機(jī)制均需進(jìn)一步研究。