Beclin1、PTEN蛋白在肝細(xì)胞癌癌組織中的表達(dá)及其對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值

高飛,柳悅,尹紀(jì)來,王永存

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，早期往往不表現(xiàn)明顯癥狀，就診時(shí)已處于中晚期，臨床預(yù)后較差，易局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者死亡[1]。目前，早期HCC患者主要采取手術(shù)治療(根治性肝切除，姑息性肝切除等)，中晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者主要采用放療、化療或其它生物治療，但其治療效果并不理想[2]。正確評(píng)估HCC患者的病情，有助于及時(shí)調(diào)整治療方案，減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，盡可能提高治療的有效性。Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白抗體(Beclin1)是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因，張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue，PTEN)也可以參與調(diào)控自噬的信號(hào)通路，達(dá)到抑癌的效果[3]。多項(xiàng)研究均表明，Beclin1和PTEN在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤均存在表達(dá)異常，且其表達(dá)量與腫瘤患者的臨床病理特征密切相關(guān)[4-5]。因此，本研究通過檢測Beclin1和PTEN在HCC組織中的表達(dá)，分析了其表達(dá)與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，旨在明確Beclin1和PTEN在HCC治療和預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月至2016年1月在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的78例被確診的原發(fā)性HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為HCC并適合手術(shù)治療者；術(shù)前均未接受過放射治療、化療；臨床資料完整，獲得患者及其家屬同意；且通過該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性HCC患者；合并急性嚴(yán)重感染、明顯肝腎功能不全；合并血液系統(tǒng)疾病；合并其他惡性腫瘤；無法耐受手術(shù)治療，臨床及隨訪資料不完全者。HCC患者男56例，女22例，年齡30～74歲，平均(51.67±10.54)歲，病程0.2～3年，平均(1.14±0.51)年，根據(jù)CT檢查和MRI檢查結(jié)果確定腫瘤直徑，直徑≤5 cm 36例，直徑>5 cm 42例，病理分級(jí)根據(jù)Edmondson分級(jí)法[6]，Ⅰ期11例，Ⅱ期22例，Ⅲ期25例，Ⅳ期20例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期22例，Ⅳ期19例；經(jīng)術(shù)后確診合并門靜脈癌栓34例，無門靜脈癌栓44例，合并腫瘤包膜31例,無腫瘤包膜47例，甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)≥400 ng/mL者29例，AFP<400 ng/mL者49例。收集同期的26例來源于HCC良性病變部分切除時(shí)的周圍正常肝組織作為對(duì)照組，男19例，女7例，年齡31～74歲，平均(51.94±10.43)歲。兩組年齡、性別、病程等一般資料無顯著差異。

1.2 治療方案

根據(jù)腫瘤大小和部位，對(duì)所有納入HCC患者選擇性行肝葉、肝段、半肝和局部切除術(shù)，術(shù)中采用氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020593，10 mL：0.25 g×5支)輔助治療，術(shù)后聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞及支持治療，預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1.3 檢測指標(biāo)

術(shù)前，采用ROCHE化學(xué)發(fā)光儀AFP配套檢測試劑檢測患者血清AFP含量，嚴(yán)格按操作說明進(jìn)行操作。無菌取HCC癌組織約50 mg，勻漿，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將提取的總蛋白(50 μg)樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，加5%脫脂牛奶封閉后，分別加入Beclin1、PTEN抗體(1∶1 000)和β-actin蛋白單抗(1∶300)，4 ℃下孵育過夜，最后加二抗37 ℃下孵育2 h，ECL監(jiān)測。采用Photoshop圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。參考已有研究，采用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time，RT)-PCR測定Beclin1[7]和PTEN[8]mRNA在HCC癌組織中的表達(dá)，正常肝組織及HCC組織勻漿后，Trizol法提取組織總RNA，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 隨訪

患者自病理確診之日起開始門診復(fù)查或電話隨訪，治療后1年內(nèi)每3個(gè)月門診復(fù)查1次，2年內(nèi)半年復(fù)查1次，以后至少每年復(fù)查一次，復(fù)查患者的肝功能生化指標(biāo)、AFP水平以及影像學(xué)(超聲顯像、電子計(jì)算機(jī)X線體層攝影或PET-CT檢查)。隨訪截止2018年1月，共計(jì)隨訪24個(gè)月～60個(gè)月，平均隨訪時(shí)間(39.44±10.86)個(gè)月。隨訪記錄患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移判定標(biāo)準(zhǔn)為CT或MRI等影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝或其他器官(肺、胸腔、腦、骨等)內(nèi)存在新病灶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Beclin1和PTEN在HCC組織中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，HCC癌組織中Beclin1mRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)[(1.00±0.10)vs(1.48±0.14)，t=19.071，P<0.001；(0.88±0.07)vs(1.42±0.13)，t=26.929，P<0.001]，PTENmRNA和蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)[(1.00±0.10)vs(0.67±0.06)，t=15.870，P<0.001; (1.31±0.12)vs(0.78±0.07)，t=27.528，P<0.001]，見圖1。

2.2 HCC癌組織中Beclin1和PTEN蛋白的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系

Beclin1蛋白的表達(dá)與HCC患者與腫瘤直徑、病理分級(jí)、TNM分期、有無門靜脈癌栓和AFP含量有關(guān)(P<0.05)；PTEN蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、病理分級(jí)、TNM分期、有無門靜脈癌栓和AFP含量有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 HCC癌組織中Beclin1和PTEN蛋白的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系

2.3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者術(shù)前癌組織中Beclin1和PTEN蛋白的表達(dá)

與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者相比，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HCC組織中Beclin1蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PTEN蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者術(shù)前癌組織中Beclin1和PTEN蛋白的表達(dá)

2.4 術(shù)前Beclin1和PTEN預(yù)測HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線分析

表3 Beclin1和PTEN聯(lián)合預(yù)測的Logistic回歸分析

3 討論

原發(fā)性HCC是我國常見的惡性腫瘤之一，主要指由肝膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞或兩者混和發(fā)生的惡性腫瘤[9]。目前，原發(fā)性HCC的病因和發(fā)病機(jī)制尚未確定，臨床治療主要采取手術(shù)治療方法，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，有效提高HCC患者的預(yù)后是治療HCC的關(guān)鍵[10]。臨床通常將腫瘤患者腫瘤分期、腫瘤體積、腫瘤分化程度等病理特征作為評(píng)價(jià)HCC預(yù)后的重要指標(biāo)[11]。但這些臨床病理特征具有一定局限性及滯后性，不足以準(zhǔn)確評(píng)估HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，尋找新的預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物對(duì)于HCC的預(yù)后具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1在HCC組織中表達(dá)量顯著升高，且其表達(dá)量與HCC腫瘤病理分級(jí)、TNM分期及有無膽管癌栓相關(guān)，表明異常高表達(dá)的Beclin1參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，有望作為其預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物。Beclin1也稱為BECN1，是一種自噬相關(guān)的抑癌基因，通過調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。Fei等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Beclin1的表達(dá)量顯著下降，且Beclin1與腫瘤的臨床分期顯著相關(guān)。然而段昌虎等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1在HCC組織中表達(dá)量顯著升高。近期于海等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，Beclin1在HCC組織中表達(dá)量異常升高，且其表達(dá)量與病理學(xué)分級(jí)和有無膽管癌栓相關(guān)，與本研究結(jié)果基本一致，提示Beclin1可能在HCC組織中特異性的表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與HCC的惡性發(fā)展密切相關(guān)。

圖2Beclin1和PTEN預(yù)測HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線分析

表4 Beclin1和PTEN預(yù)測HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC特征

本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在HCC組織中表達(dá)量顯著下調(diào)，且其表達(dá)量與HCC腫瘤病理分級(jí)、TNM分期及有無膽管癌栓相關(guān)。PTEN基因位于人染色體10q23.3，是第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，可以通過負(fù)調(diào)控PI3K/AKT通路調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[16]。吳金柱等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在HCC組織中的表達(dá)量顯著下降，且其表達(dá)量與AFP水平、腫瘤大小、分化程度、有無癌栓等相關(guān)。張萌等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，PTEN可以參與調(diào)控人HCC HepG2細(xì)胞的PI3K/AKT通路，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，與本研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)PTEN在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可能通過調(diào)控機(jī)體關(guān)鍵信號(hào)通過，抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，臨床有望作為HCC診斷治療的新靶點(diǎn)。

本研究中，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者Beclin1的表達(dá)顯著上調(diào)，PTEN的表達(dá)顯著下調(diào)。Beclin1是一種自噬相關(guān)的基因，是反應(yīng)機(jī)體自噬活性的標(biāo)志蛋白[19]。劉飛等[20]的研究顯示，Beclin1水平升高可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移，與本研究結(jié)果基本一致，提示Beclin1可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)HCC患者術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。PTEN是一種抑癌基因，研究顯示[21]，PTEN與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以通過多條信號(hào)通路抑制腫瘤的侵襲和遷移，包括PTEN/FAK、Ras/MAPK、基質(zhì)金屬蛋白酶等，提示PTEN表達(dá)下調(diào)可能與HCC患者術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望作為其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。本研究采用ROC分析發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌癌組織中Beclin1和PTEN的表達(dá)對(duì)HCC患者的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測價(jià)值，Beclin1聯(lián)合PTEN檢測對(duì)HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值明顯升高，提示臨床在有條件的情況下可通過聯(lián)合檢測HCC患者癌組織中Beclin1和PTEN的表達(dá)，來評(píng)估患者的病情發(fā)展和預(yù)后，選擇合適的治療方案，減少術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高患者預(yù)后。

綜上所述，Beclin1在HCC組織中表達(dá)量顯著上調(diào)，PTEN在HCC組織中表達(dá)量顯著下調(diào)，且其表達(dá)量與腫瘤直徑，分化程度、臨床分期、有無門靜脈癌栓以及AFP含量相關(guān)，Beclin1聯(lián)合PTEN對(duì)HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有較高的預(yù)測價(jià)值。但Beclin1和PTEN相互作用于HCC的機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。本研究不足之處為樣本量較少，可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定誤差，但本研究為臨床Beclin1和PTEN在HCC的診斷或治療中提供了一定的理論依據(jù)。