外泌體miR-222對進展期胃癌接受FOLFOX新輔助化療療效評價的意義

周典偉，鄭萍，郭芬，徐建華*

在我國，由于早期胃癌及癌前病變篩查尚未普及，多數(shù)患者確診時已至進展期，腫瘤細胞已侵犯漿膜層或發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此單純接受手術(shù)治療預后較差，甚至是根治性切除(radical resection，R0)切除依然無法降低患者術(shù)后復發(fā)風險，這種結(jié)局主要與手術(shù)時瘤床或遠處殘留的病灶有關[1]。自Frei首先提出術(shù)前 “新輔助化療(Neo-adjuvant chemotherapy，NACT)”[2]的概念以來，大大提高了進展期胃癌患者的手術(shù)成功率和生存獲益率，逐漸成為胃癌治療的標準模式。其中基于鉑類藥物的化療方案在臨床上的應用較為廣泛，奧沙利鉑+5-氟尿嘧啶+亞葉酸鈣方案(FOLFOX方案)的療效已在胃癌[3]、大腸癌[4]及胰腺癌[5]的治療中得到明確證實，但是鮮少見到關于進展期胃癌的報道。筆者基于多年臨床經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)進展期胃癌患者采用FOLFOX方案得到的病理學緩解率雖然較高，但仍有部分患者會發(fā)生繼發(fā)性耐藥。如何篩選出TP方案新輔助化療敏感患者，以避免無效和過度治療，是胃癌治療領域一直關注的熱點。非編碼小分子RNA(microRNA，miRNA)具有高度保守的基因序列，調(diào)控機制復雜，可作為胃癌治療領域的潛在生物標志物[6]。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)靈敏度令人滿意的miRNAs作為臨床療效的評估指標。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNAs是被包裹在“外泌體”中發(fā)揮生物學作用，從而保證了其結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性[7]。前期有學者證實，miR-222在化療耐藥的乳腺癌細胞株中外泌體中呈高表達[8]。鑒于上述，本研究主要探討進展期胃癌FOLFOX方案NACT療效與外泌體miR-222表達的關系，以期為胃癌患者個體化治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年7月至2018年5月期間在我院進行手術(shù)切除治療的192例進展期胃癌(cT3/4N0/+M0)患者的臨床資料。納入標準：①經(jīng)超聲胃鏡、CT和腹腔鏡探查確診為進展期胃癌且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；②均接受FOLFOX新輔助化療方案；③體力Karnofsky評分>70分，美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)評分[9]為0～2分；④無手術(shù)禁忌癥者，NACT后2～3周后行手術(shù)治療；⑤患者自愿簽署知情同意書，且依從性良好。排除標準：①不符合上述納入標準的患者；②無慢性基礎性疾病或干擾病情判斷的其他癥狀；③有放化療、靶向治療或其他抗腫瘤治療史者。192例患者中，男性127例(66.15%)，女性65例(33.85%)。年齡為29～84歲，平均年齡為(59.31±12.84)歲。對臨床資料完整的患者進行手術(shù)和術(shù)后隨訪。按照國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer，UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)頒布的腫瘤TNM分期(第7版)標準[10]，T3期107例，T4期85例；N0期30例，N1期11例，N2期89例，N3期62例；無Ⅰ期病例，Ⅱ期68例，Ⅲ期95例，Ⅳ期29例；首次手術(shù)記錄分析，全組192例胃癌患者均施行胃癌根治術(shù)，其中行胃大部切除114例，全胃切除78例；高/中分化58例(包括管狀腺癌、乳頭狀腺癌)，低分化134例(包括低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌)。本研究全過程遵從赫爾辛基宣言標準，研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準，且在充分告知可能存在的風險后與所有患者簽署了知情同意書。

1.2 治療

常規(guī)行鎖骨下深靜脈置管，行FOLFOX新輔助化療方案。奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20000337)85 mg/m2，iv， d1，聯(lián)合5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準字H31020593)400 mg/m2，iv，d1～d4，以及亞葉酸鈣(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H32022391)600 mg/d，每2周為1個周期，進行2～4個周期NACT。根據(jù)超聲內(nèi)鏡、螺旋CT檢查結(jié)果，由本院同一組經(jīng)驗豐富的醫(yī)師團隊評價化療效果，如評估為有效或穩(wěn)定，則在化療結(jié)束2～3周后進行手術(shù)；若出現(xiàn)疾病進展則終止化療，立即實施手術(shù)。手術(shù)方案由手術(shù)醫(yī)師根據(jù)術(shù)前和術(shù)中情況評估決定。

1.3 療效評價

所有患者完成2～4個周期NACT后，依據(jù)美國病理學家協(xié)會(College of American Pathologists，CAP)制定的腫瘤退縮分級(tumor regression grade，TRG)[11]判定結(jié)果：病理完全緩解(pathology complete response，pCR)：TRG0，腫瘤組織和淋巴結(jié)內(nèi)未見浸潤性癌細胞殘留；病理部分緩解(pathology partial response，pPR)：TRG1，存在單個或微小病灶；療效小(TRG2)：殘留癌病灶伴纖維增生；療效差(TRG3)：療效微小或無療效，癌細胞大量殘留。

1.4 研究方法

1.4.1 血液標本采集 為減少干擾因素，于8∶00～10∶00 am采集患者空腹外周靜脈血3～4 mL于分離膠+促凝劑真空采血管，3 500 rpm離心10 min分離血清，置于EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 外泌體分離和鑒定 采用PureExo外泌小體提取試劑盒提取血清中的外泌體，置于透射電鏡下觀察。采用TRIzol法提取外泌體中的RNA。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用NadoDrop ND-1000分光光度計檢測RNA濃度(當A260/A280為1.6～1.8時，判斷RNA純度較高)。根據(jù)miRcute血清分離試劑盒說明書提取外泌體中的miRNAs。采用One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit進行RT反應。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以GAPDH作為內(nèi)參。冰浴中配制20 μL PCR反應體系，95 ℃ 10 min預變性，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)40次，60 ℃ 5 min循環(huán)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的資料設計引物。根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。2-ΔΔCt>中位值則為高表達組，否則為低表達組。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡下所見外泌體形態(tài)

在透射電鏡下觀察，可見大量脂質(zhì)雙層膜囊狀、直徑約為30～150 nm的圓形顆粒，即為外泌體(圖1)。

圖1 透射電鏡下觀察外泌體的顆粒形態(tài)(×40 000)

2.2 進展期胃癌患者外泌體miR-222表達量與臨床病理特征的關系

進展期胃癌患者循環(huán)外泌體miR-222的平均表達量為(1.387±0.096)，其中100例(52.08%)患者外泌體miR-222呈高表達(高于均值定義為高表達，低于均值定義為低表達)，92例(47.92%)患者外泌體miR-222呈低表達。外泌體miR-222表達水平與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期存在顯著相關性(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位等無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

2.3 新輔助化療前后循環(huán)外泌體中miR-222水平變化及其相關性分析

所有患者全部完成NACT，平均接受(3.22±0.77)個周期FOLFOX方案治療后行外科手術(shù)。治療前所有患者循環(huán)外泌體miR-222的平均表達量為(1.387±0.096)，輔助化療后為(1.291±0.059)，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.81，P<0.0001)。47例(24.48%)患者獲得pCR，其循環(huán)外泌體中miR-222水平為(1.251±0.041)，145例(75.52%)患者未獲得pCR，其循環(huán)外泌體中miR-222水平為(1.308±0.047)，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.62，P<0.05)此外，在治療過程中出現(xiàn)的不良反應均能通過藥物治療得到緩解，保證化療順利完成。有153例(79.69%)患者獲得R0切除。

2.4 影響新輔助化療療效的單因素分析

pCR組和非pCR組分別有15例(31.91%)患者和85例(58.62%)循環(huán)外泌體miR-222呈高表達，兩組差異存在統(tǒng)計學意義(2=10.14，P=0.001)。2檢驗結(jié)果顯示，腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、NACT周期以及循環(huán)外泌體miR-222表達量與pCR顯著相關(P<0.05)，見表2。

表1 研究對象循環(huán)外泌體miR-222表達與臨床特征的關系[n(%)]

2.5 影響進展期胃癌患者獲得pCR的多因素Logistic回歸分析

以化療療效為因變量(pCR=1，非pCR=0)，將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量納入多因素Logistic回歸分析模型中進行分析。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、miR-222高表達是患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

2.6 循環(huán)外泌體miR-222對進展期胃癌患者NACT療效的預測價值

經(jīng)ROC曲線分析顯示，循環(huán)外泌體miR-222預測進展期胃癌一線FOLFOX方案NACT療效的AUC為0.74(95%CI：0.55-0.85)，P=0.005，最佳截斷值為1.255，靈敏度為0.643，特異度為0.775,見圖2。

表2 影響新輔助化療療效的單因素分析[n(%)]

表3 影響進展期胃癌患者獲得pCR的多因素Logistic回歸分析

圖2循環(huán)外泌體miR-222預測進展期胃癌FOLFOX方案NACT療效的ROC曲線

3 討論

胃癌是我國癌癥相關死亡的第二大因素，嚴重威脅國民的生命健康[12]。目前，外科手術(shù)仍然是胃癌患者唯一有治愈可能的治療手段[13]，但是對于進展期胃癌患者由于腫瘤細胞已經(jīng)侵犯漿膜層或出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移或腹腔種植轉(zhuǎn)移，需要先接受一段時間的NACT，盡量縮小原發(fā)灶以提高R0切除的可能[14]。此外，NACT還可以消除進展期胃癌患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移灶，降低術(shù)后復發(fā)率，改善患者預后。目前，F(xiàn)OLFOX化療方案是進展期胃癌患者的標準一線方案[15]，根據(jù)“藥理作用與細胞動力學相配合、藥物毒性不疊加”的原則，F(xiàn)OLFOX方案采取5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、亞葉酸鈣3種藥物聯(lián)合使用，5-氟尿嘧啶通過抑制胸苷合成酶的活性，干擾腫瘤細胞的核酸代謝；奧沙利鉑作為第三代鉑類化合物，可以改變細胞膜通透性，延長5-氟尿嘧啶對胸苷合成酶的抑制作用；亞葉酸鈣在體內(nèi)可代謝為5,10-甲羥四氫葉酸，與胸苷合成酶和5-氟尿嘧啶形成復合物，進一步降低胸苷合成酶的活性，因此這三類藥物可協(xié)同作用，增強抗腫瘤療效[16]。雖然多數(shù)患者經(jīng)FOLFOX方案治療后可獲益，但仍有部分患者可能發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥[17]。因此，如何篩選出這部分高?；颊?，選擇更合理的個體化治療方案，是提高進展期胃癌患者根治性切除率和手術(shù)成功率的關鍵。

進入本世紀以來，涌現(xiàn)出大量腫瘤相關標記分子，但是由于胃癌發(fā)病的復雜性，多數(shù)預后相關分子靶標的特異性和敏感性較低。miRNAs與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、分化等過程的關系是近幾年醫(yī)學界的研究熱點。相對于其他蛋白分子，miRNAs穩(wěn)定性更高、調(diào)控范圍更廣[18]。但是，與組織RNA不同，由于循環(huán)RNA易被酶降解，穩(wěn)定性較差，表達量較低。上個世紀后期，逐漸有學者發(fā)現(xiàn)miRNAs是被包裹在外泌體中發(fā)揮生物學調(diào)節(jié)作用，從而保證了miRNAs的穩(wěn)定性和完整性。許多研究證實，miR-222在結(jié)直腸癌[19]、乳腺癌[20]等耐藥細胞株中表達上調(diào)，而且與PTEN/Akt/FOXO1、Notch1、MAPK等信號通路的調(diào)控有關。在前期調(diào)研工作中，我們?yōu)榱俗C實miR-222與進展期胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及治療可能的相關性，通過miRanda，miRDB，PicTar和TargetScan在線數(shù)據(jù)庫篩選了miR-222下游靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-222主要與化療耐藥相關轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控有關，包括ERCC1、TUBB3和RRM1等。但是鮮少見有臨床研究分析外泌體miR-222與進展期胃癌患者臨床病理特征以及NACT療效的關系。本研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)外泌體miR-222的高表達與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期存在顯著相關性，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位則無關；而且miR-222低表達患者接受NACT治療周期越短，采取R0切除術(shù)的可能性越高。上述結(jié)果表明，miR-222可能在胃癌組織中表現(xiàn)出功能基因的活性，與腫瘤細胞的化療抗性有關，這與我們通過生物信息篩查得到的靶基因預測結(jié)果基本一致。

既往對于進展期胃癌患者多采用單藥化療方案，但是單藥化療的有效率較低，尤其對于進展期胃癌患者，pCR率較低，療效不理想。為了提高患者的臨床療效，近些年多采用兩藥或三藥聯(lián)合的化療方案，以鉑類藥物為基礎的綜合化療方案其安全性和有效性均良好[21]。在本項研究中，192例患者接受2～3周期FOLFOX方案化療后，47例(24.48%)患者獲得pCR，145例(75.52%)患者未獲得pCR。且pCR組患者循環(huán)外泌體miR-222的平均表達量明顯低于非pCR組患者，提示miR-222與FOLFOX方案的病理療效有關。經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-222可能與FOLFOX化療不敏感有關，再次證實外泌體miR-222高表達是影響進展期胃癌患者獲得pCR的獨立危險因素。

綜上所述，進展期胃癌患者循環(huán)外泌體miR-222表達量與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關，有望成為進展期胃癌患者接受FOLFOX方案進行NACT療效評估的標志分子。外泌體miR-222表達量升高，則進展期胃癌患者易出現(xiàn)對鉑類和氟尿嘧啶為主的NACT耐藥，為以后開發(fā)針對外泌體miRNA的新的靶向治療藥物提供一定理論依據(jù)。必須承認，目前要將miRNAs廣泛用于診斷和預后評估仍有很多障礙需要克服。