阿司匹林對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響

邱燕玲 聶敏海 余麗 陳雨荷 劉旭倩

臨床觀察發(fā)現(xiàn)同時(shí)患有心血管疾病和牙周炎的患者，在服用阿司匹林后牙齦易出血，牙周炎癥狀較重，牙齦指數(shù)(GI)、齦溝出血指數(shù)(SBI)、探診深度(PD)、附著喪失(AI)、松動(dòng)度(M)等均較未服用阿司匹林者呈現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。阿司匹林是臨床常用藥物，廣泛用于心血管疾病、合并心血管疾病的糖尿病，以及結(jié)直腸癌一級(jí)預(yù)防[1]、高危妊娠女性先兆子癇預(yù)防[2]等。諸多研究表明，阿司匹林和牙周炎關(guān)系密切。Du等[3]研究發(fā)現(xiàn)在富含血小板纖維蛋白的環(huán)境中，阿司匹林的緩慢釋放可促進(jìn)牙周韌帶間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。Ding等[4]通過臨床對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，長期服用小劑量阿司匹林的慢性牙周炎和冠心病患者，在不停藥的情況下，可正常開展牙周病的機(jī)械治療，能夠正常止血。Elkhouli[5]通過隨機(jī)雙盲法實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)2級(jí)分叉的牙周病變患者中，同時(shí)服用小劑量阿司匹林者比單純植骨者牙周袋深度減低、臨床附著增加，表明植骨與阿司匹林聯(lián)合治療可有效控制牙周炎癥。牙周病治療的目的即是獲得牙周支持組織的再生，人牙成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作為牙周膜和牙齦最主要的細(xì)胞，是牙周支持組織的重要組成部分，是誘導(dǎo)牙周組織再生的基礎(chǔ)細(xì)胞，進(jìn)一步探討阿司匹林對(duì)HGFs的影響，將為牙周病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙齦組織來源 健康青少年牙齦組織取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科門診，經(jīng)患者和/或監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書后，切取少量下頜阻生智齒拔除時(shí)無炎癥牙齦，患者年齡18～24 歲。

1.1.2 主要試劑和藥品 阿司匹林(Sigma，美國)，實(shí)驗(yàn)前取18.0 mg阿司匹林粉末溶解于0.1 ml二甲基亞砜(Sigma)，加入10 ml完全培養(yǎng)基，配置10 mol/L的阿司匹林培養(yǎng)液，0.22 μmol/L濾膜(Sigma)過濾除菌后4 ℃保存，待配成所需濃度。DMEN低糖培養(yǎng)液(HYCLONE，美國)，含15%胎牛血清(HYCLONE)、2%青鏈霉素(HYCLONE)。MTT試劑盒(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基)等。

1.1.3 主要儀器 2300型恒溫CO2培養(yǎng)箱、EPICS XL型流式細(xì)胞儀(Coulter公司 ，美國)，KDC-1044低速離心機(jī)(安徽中科中佳)，自動(dòng)酶標(biāo)光度儀(Biotect，美國)，倒置顯微鏡(SHELLAB，美國)等。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的分離與培養(yǎng) 取18～24 歲健康青少年阻生智齒拔除時(shí)小部分牙齦組織，通過組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，常規(guī)胰酶消化傳代[6]。

1.2.2 HGFs的鑒定 免疫組化SP法鑒定細(xì)胞來源。滴定細(xì)胞爬片，10%甲醛固定，分別進(jìn)行抗Vimentin抗體和抗CK抗體孵育，倒置顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.3 MTT法檢測(cè)增殖 分別取第2至第5代HGFs消化制備成1×105/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀于24、48、72、96 h檢測(cè)相應(yīng)A值，繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)阿司匹林促增殖濃度范圍 取處于對(duì)數(shù)生長期的第3代HGFs，胰酶消化制備成1×105/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，實(shí)驗(yàn)分11 組，9 個(gè)實(shí)驗(yàn)組(A-I)，1 個(gè)空白對(duì)照組(J)，1 個(gè)對(duì)照組(K)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。A-I組分別加入0.25、0.5、0.8、2、4、6、8、10、12 mol/L阿司匹林培養(yǎng)液各100 μl；J組不加細(xì)胞，不加阿司匹林，為空白對(duì)照組；K組加檢測(cè)細(xì)胞，為對(duì)照組。邊緣孔填充無菌PBS，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液。分別于24、48、72 h，各加入CCK-8液10 μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)A值，繪制不同濃度阿司匹林處理后在不同時(shí)間點(diǎn)的A值柱狀圖。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HGFs的凋亡 實(shí)驗(yàn)分組同上，每組4 個(gè)復(fù)孔。處理48 h后PBS洗滌，不含EDTA的胰酶消化制備成5×105/ml的單細(xì)胞懸液，加入500 μl的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-EGFP混勻后，再加入5 μl的Propidium lodide混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min左右，流式細(xì)胞儀檢測(cè)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組均數(shù)間比較，采用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 HGFs的分離與培養(yǎng)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)收集12 例牙齦組織，均在6 d左右開始有細(xì)胞游出，以組織塊為中心成放射狀排列(圖 1A)。分別采集不同代次細(xì)胞倒置顯微鏡下圖像，觀察到細(xì)胞傳代后貼壁良好，生長速度快，形態(tài)穩(wěn)定，呈梭形或紡錘形，有多個(gè)較長突起，包漿豐滿，核呈圓形或卵圓形，有1～3 個(gè)核仁。細(xì)胞長至底壁80%左右，開始呈現(xiàn)漩渦狀、柵欄狀(圖 1B) 。

圖 1 HGFs原代培養(yǎng)(A)和傳代培養(yǎng)(B) (倒置顯微鏡, A: ×100; B: ×40)

Fig 1 The primary(A) and passage(B) culture of HGFs (Inverted microscope, A: ×100; B: ×40)

2.2 MTT最佳代次選擇結(jié)果

圖像近似“S”形，接種24～48 h生長較為緩慢，48～72 h生長最為迅速，72 h后細(xì)胞數(shù)量趨于穩(wěn)定，之后緩慢下降。細(xì)胞生長曲線呈“滯緩-對(duì)數(shù)生長-平臺(tái)”模式(圖 2)。

2.3 免疫組化鑒定結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：細(xì)胞Vimentin蛋白染色陽性，胞漿均質(zhì)黃染(圖 3A)。CK蛋白染色陰性，胞漿不著色(圖 3B)。

圖 2 第2～5代細(xì)胞增殖曲線

2.4 不同濃度阿司匹林對(duì)HGFs增殖的影響

不同濃度藥物組與對(duì)照組A值在24～96 h呈先上升后下降趨勢(shì)，在72 h，A值達(dá)到最大(圖 4)。低濃度組(0.25、0.5、0.8 mol/L)與對(duì)照組相比，A值均高于對(duì)照組(P<0.05)；中高濃度組(2、4、6、8、10、12 mol/L)與對(duì)照組相比，A值明顯減低(P<0.01)。低濃度組組內(nèi)、中濃度組組內(nèi)、高濃度組組內(nèi)A值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 不同濃度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情況

隨著阿司匹林濃度增加，細(xì)胞凋亡增多。各組內(nèi)單因素方差比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 5)。

圖 3 波形絲蛋白(A)和角蛋白(B)在HGFs中的表達(dá) (IHC, A: ×100; B: ×200)

Fig 3 Vimentin(A) and Keratin(B) expression of HGFs (IHC, A: ×100; B: ×200)

圖 4 不同濃度及時(shí)間阿司匹林對(duì)HGFs增殖的影響

Fig 4 The proliferation of HGFs treated with various concentration of aspirin and for different period

圖 5 不同濃度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情況

3 討 論

阿司匹林在最初因鎮(zhèn)痛、退熱作用被廣泛使用，后又發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗血栓、消炎以及治療心血管疾病、糖尿病，預(yù)防高危妊娠女性先兆子癇等作用。長期臨床觀察以及實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)阿司匹林不僅通過抗凝途徑對(duì)牙周病產(chǎn)生影響，還直接對(duì)牙周組織產(chǎn)生影響。Li等[8]研究表明，牙周病的炎性環(huán)境導(dǎo)致組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5表達(dá)降低，從而降低牙周韌帶干細(xì)胞的成骨分化。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射阿司匹林可上調(diào)GCN5、控制牙周炎癥、促進(jìn)牙周韌帶干細(xì)胞成骨分化。而Rahman等[9]研究也發(fā)現(xiàn)阿司匹林可調(diào)節(jié)生長相關(guān)基因的表達(dá)以及促進(jìn)牙周韌帶干細(xì)胞的成骨分化。也有對(duì)照研究表明[10]，氯吡格雷可顯著降低炎性浸潤,促進(jìn)膠原纖維數(shù)量增加，而對(duì)照組阿司匹林在牙周炎的使用中不能防止骨質(zhì)流失。這些研究主要集中在阿司匹林對(duì)牙周韌帶干細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響，而HGFs作為牙周組織最重要的細(xì)胞之一，目前國內(nèi)外少見有報(bào)道。HGFs是牙齦結(jié)締組織中的主要細(xì)胞，具有活躍的自我更新能力，不僅可以合成膠原纖維、彈力纖維，同時(shí)也是結(jié)締組織基質(zhì)的重要組成成分，王坤等[11]研究發(fā)現(xiàn)HGFs具有一定的潛在成骨能力，有望成為牙周組織工程的種子細(xì)胞；牙齦組織較牙周膜來源更為廣泛，取材時(shí)創(chuàng)傷較小，取材量更大，且體外培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞成功率高于牙周膜成纖維細(xì)胞；在牙周炎初期，炎癥首先波及牙齦組織，因此建立HGFs模型將有利于對(duì)牙周病發(fā)病機(jī)制的探討及牙周病防治。

本實(shí)驗(yàn)以HGFs為切入點(diǎn)，進(jìn)行HGFs培養(yǎng)，免疫組化鑒定，MTT最佳代次選擇，通過不同濃度阿司匹林作用后檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡，以探討阿司匹林對(duì)HGFs是否有影響。

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的組織塊貼壁法，操作簡(jiǎn)便，成功率高。在培養(yǎng)過程中，可見有立方狀上皮細(xì)胞首先游出，但HGFs增殖能力明顯強(qiáng)于牙齦上皮細(xì)胞，且胰酶消化時(shí)，HGFs敏感性強(qiáng)，可首先被消化分離，通過多次傳代消化，HGFs可得到充分純化。免疫組化SP法顯示，細(xì)胞抗Vimentin染色陽性，抗CK染色陰性，證明細(xì)胞來源于中胚層[12]，結(jié)合取材部位，可充分證明細(xì)胞是牙齦成纖維細(xì)胞。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需要良好的細(xì)胞狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)MTT最佳代次選擇實(shí)驗(yàn)，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，顯示第3代HGFs形態(tài)穩(wěn)定，狀態(tài)良好，增殖速度快，適用于實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)選用第3代HGFs，通過加入不同濃度阿司匹林，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。阿司匹林濃度范圍的確定則基于文獻(xiàn)以及前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8結(jié)果顯示：低濃度阿司匹林(≤0.8 mol/L)對(duì)HGFs有促進(jìn)增殖作用，中高濃度(≥2 mol/L)阿司匹林則明顯抑制細(xì)胞增殖，且濃度越高，抑制作用越明顯?？紤]原因?yàn)椋喊⑺酒チ肿鳛橐环N酸性藥物，PH過低可影響細(xì)胞活性，隨著藥物濃度的增加，PH可明顯降低，故對(duì)細(xì)胞活性影響較大。而在較低濃度，培養(yǎng)基PH變化不大，故對(duì)細(xì)胞活性影響不大，未能掩蓋阿司匹林本身對(duì)細(xì)胞的促增殖作用。因此本實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步改進(jìn)：調(diào)節(jié)加藥后培養(yǎng)液PH以減少培養(yǎng)液酸堿性對(duì)細(xì)胞活性的影響；縮小藥物濃度間隔以找到最佳促增殖濃度以及最低抑制濃度。在凋亡試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)分組同增殖實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果仍表明在組內(nèi)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。故實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖分別選用了空白組、0.5 mol/L組、4 mol/L組、10 mol/L組。因?qū)嶒?yàn)分組并未做到更小量化，且未對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，故最低促凋亡濃度需要進(jìn)一步探討。