耐酸性α -淀粉酶在酸面團面包抗老化中的應(yīng)用

王俊英，任 璐，王 強，李 玉，李文釗，路福平

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

新制作的面包具有較好的口感、較松軟的組織結(jié)構(gòu)且富有彈性，但是在貯藏期間，面包會出現(xiàn)由軟變硬、組織結(jié)構(gòu)松散粗糙、口感變差以及特有風(fēng)味消失的老化現(xiàn)象[1].目前，在世界范圍內(nèi)，由于老化而造成了食品的大量浪費，因此如何延長食品的貨架期就成為科研人員關(guān)心的話題.采用酸面團可以延緩老化現(xiàn)象，酸面團是由水和面粉經(jīng)由酵母和乳酸菌發(fā)酵而成的混合體系[2-3].酸面團可以提高面包的質(zhì)量和營養(yǎng)，由酸面團發(fā)酵而制作的面包具有很多優(yōu)勢，如賦予面包濃郁的香味、提高面包的感官品質(zhì)、延緩面包的老化、防止面包因染菌而引起的腐敗、延長貨架期[4-6].研究[7-9]表明，酶制劑的使用也可以延緩面包的老化，其中α-淀粉酶是最常用的酶制劑.但由于細(xì)菌α-淀粉酶容易導(dǎo)致面包心發(fā)黏的問題[10]，因此真菌α-淀粉酶更適合于面包的生產(chǎn).

目前，用于小麥面包的商業(yè)真菌α-淀粉酶大多來源于曲霉屬[11]，最適pH 為5.5～6.0.采用酸面團發(fā)酵面包通常會使面團pH 更低，顯然，大多數(shù)α-淀粉酶在此環(huán)境下將迅速失活，必然限制了α-淀粉酶在酸面團面包的應(yīng)用.到目前為止，很少有適合于應(yīng)用到酸面團面包的耐酸性α-淀粉酶的報道[12].本實驗室通過前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，黑曲霉來源的α-淀粉酶AmyE 在pH 4.5 具有最好活性，且pH 在4.0～5.0 穩(wěn)定.本文以不添加淀粉酶的樣品作為對照，比較商業(yè)α-淀粉酶與新型AmyE 對酸面團面包老化的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗原料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，天津科技大學(xué)乳制品微生物保藏中心；活性干酵母，安琪酵母有限公司；商業(yè)α-淀粉酶(CA，米曲霉來源)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；耐酸性α-淀粉酶AmyE，本實驗室制備；商業(yè)小麥高筋粉(基本成分：水分13.2%、脂肪 2%、蛋白質(zhì) 23%、灰分 0.7%、總膳食纖維2.6%)，新良糧油加工有限責(zé)任公司；鹽、白砂糖、葵花籽油為市售食品級.

HM740 型多功能廚師機，青島漢尚電器有限公司；CF-3500 型家用發(fā)酵箱，中山卡士電器有限公司；CRWF32KE 型烤箱，佛山市偉仕達(dá)電器實業(yè)有限公司；BVM6630 型面包體積測定儀，瑞典波通公司；TA.XT.Plus 型質(zhì)構(gòu)儀，英國高德明科技有限公司；S20K 型pH 計，梅特勒儀器有限公司；722N 型分光光度計，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；60 Plus/60 A 型差示掃描量熱儀，日本島津公司.

1.2 酸面團面包的生產(chǎn)工藝

1.2.1 工藝流程

植物乳桿菌的活化與培養(yǎng)→酸面團的制備→發(fā)酵→面包面團的制備→醒發(fā)→分割做型→烘焙→包裝→儲藏

1.2.2 操作要點

植物乳桿菌的活化與培養(yǎng)：取活化的植物乳桿菌置于MRS 肉湯培養(yǎng)基中30 ℃增殖培養(yǎng)12～16 h 至對數(shù)生長期(菌體濃度達(dá)到108mL-1)，5 000 r/min 離心20 min，收集乳桿菌細(xì)胞，沖洗2 次，用滅菌的0.15 mol/L 的氯化鈉溶液重懸(菌體濃度達(dá)到109mL-1)，用于面團接種.

乳酸菌酸面團的制備：100 g 小麥高筋面粉、100 mL 去離子水[14]、10 mL 的標(biāo)準(zhǔn)化植物乳桿菌懸液制備酸面團，將酸面團放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵16 h[15].

面包面團的制備與醒發(fā)：稱取小麥高筋粉(100%計)、活性干酵母(1.5%)、乳酸菌酸面團(20%)，鹽(1%)、白砂糖(6%)、葵花籽油(3%)、商業(yè)α-淀粉酶(15 U/g)或耐酸性α-淀粉酶 AmyE(0、10、15、20 U/g)、純凈水(60%)，使用HM740 型多功能廚師機攪拌10 min，混合好的面團置于醒發(fā)箱中38 ℃、65%相對濕度醒發(fā)1 h 后成為酸面包面團.空白對照為不加任何淀粉酶的面團，其他條件相同.

面包的制備：醒發(fā)好的面團統(tǒng)一分割成每個80 g，做型.將烤箱溫度設(shè)定為上層 185 ℃、下層180 ℃，放入面團烘焙30 min.烘焙結(jié)束后，將面包從模具中取出，放在貨架上室溫冷卻90 min，裝入聚乙烯食品袋包裝[16].

面包的儲藏：將完成包裝的面包于室溫(25 ℃)放置7 d，分別在0、1、3、5、7 d 取樣檢測.每組樣品作6 個平行取平均值.

1.3 應(yīng)用分析

1.3.1 pH、總酸度與還原糖含量的測定

取10 g 面包面團或面包樣品，放入90 mL 無菌蒸餾水均質(zhì).用pH 計測定溶液的pH；面團的總滴定酸度采用滴定法測量，使用0.1 mol/L 的NaOH 溶液中和均質(zhì)液直到pH 達(dá)到8.1.總滴定酸度(TTA)用消耗的NaOH 溶液的體積(mL)表示.所有的測定至少重復(fù)3 次取平均值.

稱取10 g 面包面團或面包樣品，加入90 mL 的蒸餾水，放在磁力攪拌器上，調(diào)節(jié)溫度達(dá)到50 ℃，攪拌30 min 使溶液充分?jǐn)噭?5 000 r/min 離心5 min.使用改良的DNS 法對上清液中的還原糖含量進(jìn)行測定[17].

1.3.2 面包的感官評定

請20 名人員對面包進(jìn)行感官評定，結(jié)果取平均值，感官評定的標(biāo)準(zhǔn)[18]見表1.

1.3.3 面包的質(zhì)構(gòu)特性

每個面包選取面包心，切成2 cm×2 cm×2 cm大小，使用TA.XT.Plus 質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析.選用P36R 探頭，采用TPA 檢測模式，測試速度為1.0 mm/s，壓縮到原始高度的50%，第1 次和第2 次壓縮之間的松弛時間為5 s[19].每個樣品測5 次并取平均值.

表1 酸面團面包感官評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory evaluation standards of sourdough bread

1.3.4 面包中心的水分含量

面包中心水分含量按GB/T 5009.3—2016[20]方法進(jìn)行測定.

1.3.5 面包的回生焓檢測

面包的回生焓采用60 Plus/60 A 差示掃描量熱儀(DSC)進(jìn)行測定.稱取5 mg(干基)的面包凍干粉末放入DSC 盤，加入蒸餾水，使水與面包的質(zhì)量比為3：1，DSC 盤密封后，室溫下平衡過夜，以10 ℃/min的速率加熱DSC 盤，使溫度從25 ℃升溫到120 ℃，同時以空的DSC 盤作為對照.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 19.0 軟件計算分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 面團及其面包的pH、TTA和還原糖含量

剛混合好的面包面團(醒發(fā)前)、醒發(fā)后面團以及面包的pH、TTA 和還原糖含量的測定結(jié)果如圖1所示.

隨著面團醒發(fā)的進(jìn)行，面團的pH 總體呈下降趨勢.在發(fā)酵初期，面團含有大量的空氣，酵母主要通過有氧呼吸作用進(jìn)行繁殖和代謝.隨著氧氣逐漸被消耗，酵母開始進(jìn)入無氧發(fā)酵階段，產(chǎn)生二氧化碳的過程中會產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致面團 pH 大幅降低(圖1(a)).與對照相比，在同一時期，加酶的樣品具有較低的pH 和較高的TTA(圖1(b))，并且AmyE 比CA的作用更加明顯.α-淀粉酶是一種糖苷水解酶，催化淀粉中的α-(1，4)-糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和糊精等[21].植物乳桿菌通常利用一些糖類如葡萄糖、麥芽糖、果糖作為能源，用于維持細(xì)胞生存和繁殖[22].由圖1(a)可以看出，混合面團的pH 在4.48～4.53 范圍內(nèi)，而醒發(fā)后面團的pH 在4.17～4.35 范圍內(nèi).α-淀粉酶的活性與pH 有關(guān).CA 最適pH 范圍是5.0～5.5，而AmyE 最適pH 范圍是4.0～5.0，且在pH 4.5時活性最強[13].因此混合面團中的pH 環(huán)境非常有利于AmyE 發(fā)揮作用.

圖1 混合面團、醒發(fā)面團和面包的pH、TTA和還原糖Fig.1 pH value，TTA and reducing sugar of mixed dough，proofed dough and bread

與對照相比，添加AmyE 使基質(zhì)中還原糖的水平也隨之增加(圖1(c)).還原糖含量的提高，對酵母和乳酸菌的生長和新陳代謝都會產(chǎn)生積極的影響.酸面團面包具有很多優(yōu)點，如改善面包的風(fēng)味和較強的抗菌性能，這些都與乳酸菌的新陳代謝密切相關(guān)[2,23].另一方面，增強了酵母的代謝活動，使之釋放出更多的二氧化碳，從而使面包比容增大及具有較柔軟的質(zhì)地.

2.2 新鮮面包的感官評定

不同酸面團面包的感官評定結(jié)果見表2.新鮮面包的總體得分都在85 分以上，基本達(dá)到正常面包應(yīng)有的品質(zhì).與對照相比，加入α-淀粉酶后，面包表面色澤金黃，切片具有多而均勻的氣孔結(jié)構(gòu)，面包香味更加濃郁，口感更加松軟.其主要原因是添加α-淀粉酶增加了面團中的還原糖含量，從而增強了酵母的代謝活動，產(chǎn)生更多的二氧化碳?xì)怏w，使面包的體積增大，口感更加松軟[24].同時，還原糖在面包烘焙過程中還可參與美拉德反應(yīng)，有助于增加面包的外表色澤.

表2 不同酸面團面包的感官評定結(jié)果(分)Tab.2 Sensory evaluation of different bread samples

2.3 面包儲藏過程中的質(zhì)構(gòu)變化

質(zhì)構(gòu)分析已被證明與相關(guān)的感官評定密切相關(guān)，并且可以用這些指標(biāo)評估面包的質(zhì)量[25].不同面包樣品在儲藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化如圖2 所示.

面包在儲藏期間，隨著時間的延長，面包心的硬度和咀嚼度逐漸上升，彈性逐漸下降.因此，這些變化的速度決定了面包的質(zhì)量.添加不同種類及不同濃度的α-淀粉酶對面包心質(zhì)構(gòu)的影響較大.與空白對照相比，添加AmyE 后可以顯著降低面包心的硬度和咀嚼度，增加其彈性.其中，添加量為15 U/g 效果最好，并且優(yōu)于等量的CA.不同類型的面包心樣本在內(nèi)聚性方面顯示出無顯著差異.

綜上所述，添加AmyE 的面包樣品在儲藏過程中的質(zhì)構(gòu)變化要優(yōu)于對照組和同等加酶量的商業(yè)α-淀粉酶組，其主要原因可能是AmyE 水解淀粉生成較多的還原糖，進(jìn)而可以增強酵母的代謝活動，軟化面團，改善面團的特性，因此有效減緩了面包的硬化和老化.這些結(jié)果與Roy 等[16]和Halima 等[26]使用α-淀粉酶有效地改善了面包心在儲存期間的質(zhì)構(gòu)變化、降低了老化速率的研究結(jié)果一致.

圖2 不同面包樣品在儲藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化Fig.2 Texture properties of different bread samples during storage

2.4 面包儲藏過程中水分含量的變化

將包裝好的面包在室溫放置7 d，不同面包樣品水分含量在儲藏過程中的變化結(jié)果如圖3 所示.

水分在面包老化中扮演著重要的角色.在面包儲藏過程中，水分會從面包心向面包皮遷移，導(dǎo)致面包心變硬、變干，因此失去了它的彈性和柔軟性，使口感和外形變差.由圖3 可知，所有面包心的水分含量在儲藏期間都是持續(xù)減少的.但加入α-淀粉酶后，面包在貯存期間水分的散失明顯減緩，添加AmyE的面包樣品在儲藏7 d 后水分含量(26.7%)高于添加CA 的水分含量(23.2%).其原因可能是AmyE 水解淀粉生成了具有親水作用的低聚糖(主要是麥芽糖和麥芽三糖)[13].有研究[27-28]表明小分子質(zhì)量的低聚麥芽糖，尤其是麥芽三糖和麥芽糖，可以作為保鮮劑，延緩面包的老化.

圖3 不同面包樣品水分含量在儲藏過程中的變化Fig.3 Variation of moisture content in different bread samples during storage

2.5 面包儲藏過程中回生焓的變化

為進(jìn)一步探究面包老化的原因，差示掃描量熱法(DSC)被用來檢測面包儲藏過程中淀粉的回生，不同面包樣品的回生焓變化如圖4 所示.由圖4 可以看出：剛烤出的面包檢測不到吸熱轉(zhuǎn)變；面包儲藏過程中，淀粉會出現(xiàn)回生，隨著貯存時間的延長，所有樣品的回生焓增加；對照組樣品的回生焓上升很快，5 d后趨于平衡.添加α-淀粉酶樣品的回生焓上升趨于緩慢，而且不同的α-淀粉酶種類(如AmyE 和商業(yè)α-淀粉酶)及不同添加量對回生焓的影響也不同，其中添加15 U/g AmyE 樣品的回生焓上升趨勢最緩，在第7 天時，回生焓比對照降低了26.3%.

圖4 不同面包樣品的回生焓在儲藏過程中的變化Fig.4 Retrogradation enthalpy of different bread crumb samples during storage

面包老化是一個復(fù)雜的現(xiàn)象，它受到多種因素的影響.雖然科研人員對其進(jìn)行了大量研究，但其機制仍然不清楚.推測老化主要涉及幾個不同的因素，如淀粉的回生、麥谷蛋白-淀粉的相互作用及水分的再分配[29].其中淀粉回生對面包的老化起著非常重要的作用[30].直鏈淀粉的含量較高及支鏈淀粉側(cè)鏈長度較長會加劇淀粉回生的程度.α-淀粉酶能水解淀粉鏈上的α-1，4-葡萄糖苷鍵，因此能減少直鏈淀粉的含量，并且使支鏈淀粉的分枝側(cè)鏈變短，使之變得小簇[31]，從而減緩淀粉的回生.此外，AmyE 水解淀粉的產(chǎn)物中含有小分子產(chǎn)物，如麥芽低聚糖具有較強的吸水性，減少了淀粉與麥谷蛋白之間的相互作用，也有助于延長面包的貨架期[32-33].因此，α-淀粉酶AmyE 在延緩面包老化方面效果顯著.

3 結(jié) 論

通過考察酸面團面包在儲藏過程中的質(zhì)構(gòu)特性、面包心的水分含量和回生焓的變化，可以證實耐酸性α-淀粉酶 AmyE 能夠有效減緩酸面團面包的老化.添加AmyE 的面包樣品在儲藏過程中的質(zhì)構(gòu)變化要優(yōu)于對照組和同等添加量的商業(yè)α-淀粉酶組，并且AmyE 明顯減緩了面包心水分的散失和回生焓的上升速率.其中，添加AmyE 15 U/g 的抗老化效果是最好的，儲藏7 d 后，可以使面包心硬度、咀嚼度及回生焓分別比對照降低27.1%、17.6 和26.3%.因此，AmyE 在酸面團面包抗老化方面具有很好的應(yīng)用前景.