抗精噁唑禾草靈耿氏硬草乙酰輔酶A羧化酶基因研究

袁國(guó)徽，李 濤，錢振官，田志慧，劉偉堂，王金信

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403; 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018)

耿氏硬草[Sclerochloakengiana(Ohwi)Tzvel.]，又名耿氏堿茅，禾本科硬草屬，是一年生或越年生疏叢型草本[1]。耿氏硬草具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和繁殖能力，是我國(guó)稻麥輪作區(qū)小麥田主要惡性雜草之一，通過(guò)與作物競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分、水分和光照等資源，直接或間接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。據(jù)報(bào)道，耿氏硬草在部分麥田平均密度達(dá)100株·m-2，危害嚴(yán)重的田塊可達(dá)400 株·m-2，嚴(yán)重影響小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[3]。

精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)，化學(xué)名稱為(R)-2-[4-(6-氯-1,3-苯并噁唑-2-氧基)苯氧基]丙酸乙酯，是由德國(guó)Hoechst公司開(kāi)發(fā)的芳氧苯氧丙酸類(aryloxyphenoxypropionate，APP)除草劑，其作用靶標(biāo)為乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)。ACCase是植物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，它催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A[4]。精噁唑禾草靈通過(guò)在植物體內(nèi)活化成酸的形式與ACCase羧基轉(zhuǎn)移酶(carboxyltransferase，CT)區(qū)域結(jié)合，從而抑制丙二酰輔酶A的形成，使植物的脂肪酸合成受阻，最終導(dǎo)致植物死亡[5]。精噁唑禾草靈是選擇性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗后莖葉處理劑，具有高效、低毒、殺草譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)小麥田被迅速推廣，部分地區(qū)已有十幾年的應(yīng)用歷史。隨著精噁唑禾草靈使用年限的增長(zhǎng)，其用量逐年增加，但對(duì)耿氏硬草的防除效果卻越來(lái)越差，部分地區(qū)甚至出現(xiàn)防除失敗。夏書(shū)娥等[6]報(bào)道，稻茬麥田菵草(Beckmanniasyzigachne)在連續(xù)8年使用精噁唑禾草靈后對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。趙 寧等[7]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用精噁唑禾草靈約10年的小麥田中看麥娘(Alopecurusaequalis)也產(chǎn)生了抗藥性。目前，在全球70個(gè)國(guó)家有255種雜草(148種雙子葉雜草，107種單子葉雜草)的496個(gè)生物型對(duì)23種不同作用機(jī)制的除草劑產(chǎn)生了抗藥性，其中，抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草有48種[8]。

已有研究表明，雜草對(duì)ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理主要包括：靶標(biāo)酶基因突變和過(guò)量表達(dá)，對(duì)除草劑滲透和傳導(dǎo)能力的減弱以及解毒代謝能力的提高。報(bào)道較多的是雜草ACCase基因突變導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)改變，從而阻礙除草劑與靶標(biāo)酶結(jié)合而產(chǎn)生抗藥性[9]。截至目前，在ACCase的CT區(qū)域7個(gè)位點(diǎn)(1 781、1 999、 2 027、2 041、2 078、2 088、2 096)上總共有13種不同的氨基酸突變方式在不同的抗性雜草中報(bào)道[10]。Délye等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)ACCase的第1 781位異亮氨酸(Ile)被亮氨酸(Leu)取代而產(chǎn)生抗藥性。Yuan等[12]報(bào)道，抗精噁唑禾草靈耿氏硬草ACCase的第1 999位色氨酸(Trp)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。此外，ACCase第1999位色氨酸突變?yōu)榘腚装彼?Cys)也被證實(shí)是耿氏硬草對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的機(jī)理[13]。Yu等[14]報(bào)道，雜草對(duì)ACCase抑制劑類除草劑的交互抗性與靶標(biāo)酶突變位點(diǎn)、突變種類以及雜草物種等因素相關(guān)。

本研究以采自山東省魚(yú)臺(tái)縣的抗精噁唑禾草靈耿氏硬草種群為試驗(yàn)材料，采用整株水平測(cè)定法測(cè)定供試種群對(duì)不同ACCase抑制劑類除草劑的抗性，擴(kuò)增和比對(duì)抗性和敏感種群ACCase基因CT區(qū)域序列，并測(cè)定耿氏硬草種群對(duì)其他常用除草劑的敏感性，為制定耿氏硬草的防除策略和延緩其抗性種群的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試草種：耿氏硬草抗性種群SD-23種子于2013年6月采自山東省魚(yú)臺(tái)縣老砦鄉(xiāng)四合村麥田，該麥田約有14年的精噁唑禾草靈用藥歷史；敏感種群SD-1種子采自山東省魚(yú)臺(tái)縣王魯鎮(zhèn)東華村未使用過(guò)除草劑的非耕地。經(jīng)前期單劑量測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SD-1種群植株在精噁唑禾草靈田間推薦劑量下全部死亡，而抗性種群SD-23植株在2倍田間推薦劑量下生長(zhǎng)未見(jiàn)被抑制。

供試除草劑：69 g·L-1精噁唑禾草靈水乳劑、30 g·L-1甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)可分散油懸浮劑，拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司；15% 炔草酯(clodinafop-propargyl)可濕性粉劑、5% 唑啉草酯(pinoxaden)乳油，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；7.5% 啶磺草胺(pyroxsulam)水分散粒劑，美國(guó)陶氏益農(nóng)公司；15% 精吡氟禾草靈(fluazifop-P-butyl)乳油，日本石原株式會(huì)社；12.5% 烯禾啶(sethoxydim)乳油，日本曹達(dá)株式會(huì)社；240 g·L-1烯草酮(clethodim)乳油，北京明德立達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司；70% 氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)水分散粒劑，愛(ài)利思達(dá)生物化學(xué)品有限公司；50% 異丙隆(isoproturon)可濕性粉劑，江蘇快達(dá)農(nóng)化股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 耿氏硬草對(duì)ACCase抑制劑類除草劑的抗性水平測(cè)定

供試材料培養(yǎng)參照Yuan等[15]的方法，將均勻一致的種子用1% 次氯酸鈉溶液消毒20 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。經(jīng)消毒處理后的種子放于含0.6% 瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于人工氣候箱內(nèi)催芽(溫度：白天15 ℃，晚上10 ℃；光照周期：12/12)。待種子萌發(fā)后播種于裝有壤土的塑料盆中(直徑12 cm)，每盆15株，放于溫室中培養(yǎng)(溫度15～25 ℃，自然光照，相對(duì)濕度75%)。幼苗長(zhǎng)至3～4葉期時(shí)，使用ASS-4型自動(dòng)定量噴霧系統(tǒng)進(jìn)行各除草劑處理，濃度(表1)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)定，莖葉噴霧(壓力0.275 MPa，噴液量450 L·hm-2)。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。噴藥21 d后剪取存活植株地上部分，在75 ℃干燥箱內(nèi)烘干72 h，稱干重。

1.2.2 抗性耿氏硬草ACCase基因分析

根據(jù)NCBI上報(bào)道的耿氏硬草ACCase基因序列(登錄號(hào)KJ598848.1、KJ598849.1)，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物YC-F(5′-GCTTCCACTTATCTACTTGGCT-3′)/YC-R(5′-AGGGATTCACCGTCAAATAG-3′)，用于擴(kuò)增ACCase CT區(qū)包含所有已知抗性突變位點(diǎn)的基因片段。

表1 抗性水平測(cè)定中除草劑及其處理劑量Table 1 Application amount of herbicide treatments in dose-response tests g(a.i)·hm-2

使用植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)耿氏硬草抗性和敏感種群進(jìn)行單株DNA提取，每個(gè)種群隨機(jī)選取10株。經(jīng)NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)測(cè)定提取DNA的質(zhì)量和濃度后，采用T100 PCR儀進(jìn)行基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：37 μL的ddH2O，1 μL的EasyTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)，5 μL的10×EasyTaq Buffer，4 μL的dNTPs(2.5 mmol·L-1)， 1 μL的引物YC-F(10 μmol·L-1)，1 μL的引物YC-R(10 μmol·L-1)，1 μL的基因組DNA。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將含有目的條帶的凝膠進(jìn)行DNA回收。利用pEASY-T1載體連接回收的DNA片段，然后轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中[7]，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含Amp10 μg·mL-1)上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落于LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)8～12 h，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。通過(guò)DNAMANversion 5.2.2 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 耿氏硬草對(duì)其他除草劑的敏感性測(cè)定

采用單劑量測(cè)定耿氏硬草對(duì)ALS抑制劑類除草劑甲基二磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺和PSⅡ抑制劑類除草劑異丙隆的敏感性。各除草劑處理劑量(有效成分)分別為：氟唑磺隆31.5 g·hm-2，啶磺草胺13.5 g·hm-2，甲基二磺隆13.5 g·hm-2，異丙隆1 197 g·hm-2。耿氏硬草培養(yǎng)及噴藥處理方式同1.2.1，施藥后21 d記錄每處理存活雜草株數(shù)，并剪取存活植株地上部烘干后稱重，計(jì)算株防效和干重防效。株防效=(對(duì)照組雜草株數(shù)-處理組雜草株數(shù))/ 對(duì)照組雜草株數(shù)×100%；干重防效=(對(duì)照組雜草干重-處理組雜草干重)/對(duì)照組雜草干重×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPadPrism version5.01軟件的非線性回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各藥劑對(duì)耿氏硬草抗性與敏感種群的GR50值。擬合方程：y=c+ {(d-c)/[1+(x/GR50)b]}，其中y表示處理組雜草干重相對(duì)于對(duì)照的百分比，c表示劑量反應(yīng)下限，d表示劑量反應(yīng)上限，b表示方程斜率，x表示除草劑處理劑量，GR50表示抑制雜草50%干重的除草劑劑量。通過(guò)計(jì)算抗性種群GR50與敏感種群GR50的比值得出抗性倍數(shù)。利用IBM SPSS Statistics version 20軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耿氏硬草抗性種群對(duì)ACCase抑制劑類除草劑的抗性

采用整株水平測(cè)定法測(cè)定了耿氏硬草SD-23種群對(duì)6種ACCase抑制劑類除草劑的抗性水平。結(jié)果(表2)顯示，SD-23種群對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生了高水平的抗性，對(duì)炔草酯和精吡氟禾草靈產(chǎn)生了低水平的抗性，其抗性倍數(shù)依次為12.7、5.2和4.5；對(duì)烯禾啶、烯草酮和唑啉草酯未產(chǎn)生抗性，其抗性倍數(shù)均小于2。

2.2 耿氏硬草抗性種群ACCase基因分析

對(duì)耿氏硬草ACCase基因片段進(jìn)行克隆與測(cè)序后，得到了一段長(zhǎng)度為1 359 bp的序列。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)該堿基序列為耿氏硬草的質(zhì)體型ACCase基因序列。將耿氏硬草抗性種群SD-23與敏感種群SD-1以及大穗看麥娘的ACCase基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明，抗性SD-23種群所檢測(cè)的10株耿氏硬草均發(fā)生了相同的突變，即ACCase基因CT區(qū)域第6 287位(參照大穗看麥娘質(zhì)體型ACCase序列)堿基G突變?yōu)镃，導(dǎo)致第2 096位氨基酸由甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala)；敏感種群中所有植株均未發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的抗性突變位點(diǎn)(表3)。

2.3 耿氏硬草抗性種群對(duì)其他4種除草劑的敏感性

從表4得知，在各藥劑的田間推薦劑量下，抗性種群SD-23與敏感種群SD-1對(duì)甲基二磺隆、啶磺草胺、氟唑磺隆和異丙隆的株防效及干重防效之間的P值均大于0.05，所以耿氏硬草種群SD-23與SD-1之間對(duì)上述4種除草劑抗性均無(wú)顯著性差異。從各除草劑對(duì)耿氏硬草種群的株防效和干重防效來(lái)看，氟唑磺隆的防除效果最差，其株防效為20.0%～22.2%，干重防效為36.6%～37.8%；而甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆對(duì)耿氏硬草種群均有較好防效，其株防效為86.7%～100%，干重防效為77.4%～84.7%。因此，甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆可用于抗ACCase抑制劑類除草劑耿氏硬草的防除。

表2 耿氏硬草抗性種群對(duì)ACCase抑制劑類除草劑的交互抗性Table 2 Resistance spectrum to ACCase-inbibiting herbicides of the resistant S.kengiana population

c：劑量反應(yīng)下限；d：劑量反應(yīng)上限；b：斜率；GR50：抑制雜草50% 干重的除草劑劑量；95% CL：95%置信區(qū)間。

c:The minimum dosage;d:The maximum dosage;b:The relative slope; GR50:Herbicide dosage causing 50% plant growth reduction; 95%CL:95% confidence limit.

表3 耿氏硬草抗性與敏感種群ACCase CT區(qū)域基因序列分析Table 3 Sequence alignment and deducedamino acid of the resistant and susceptible S.kengiana populations

氨基酸序列位置參照大穗看麥娘質(zhì)體型ACCase(AJ310767)；突變氨基酸及相應(yīng)的密碼子在表中用下劃線標(biāo)出。

The amino acid residue sequence according to the plastidic ACCase sequence ofAlopecurusmyosuroides(AJ310767); the mutated amino acid residues and corresponding codon were underlined.

表4 耿氏硬草抗性種群對(duì)其他4種除草劑的敏感性Table 4 Sensitivity of the resistant S.kengiana population to other four herbicides

P>0.05表示抗性種群與敏感種群間無(wú)顯著性差異。

Pvalue less than 0.05 means there is no significant difference between the resistant and susceptible populations at 0.05 level.

3 討 論

目前，ACCase抑制劑類除草劑主要有三種類型，分別為芳氧苯氧丙酸類(APP)，環(huán)己烯酮類(cyclohexanedione，CHD)和苯基吡唑啉類(phenylpyazoline，PPZ)。本研究中精噁唑禾草靈、炔草酯和精吡氟禾草靈屬于APP類除草劑；烯草酮和烯禾啶屬于CHD類除草劑；而唑啉草酯屬于PPZ類除草劑，是較新的一類ACCase抑制劑類除草劑。由于ACCase抑制劑類除草劑的作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期重復(fù)使用該類除草劑極易導(dǎo)致雜草抗藥性的產(chǎn)生。Tang等[16]報(bào)道，棒頭草(Polypogonfugax)在連續(xù)使用炔草酯和高效氟吡甲禾靈約5年后產(chǎn)生了抗藥性。本研究中，耿氏硬草種群SD-23對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生了高水平的抗性，這可能與其多年的精噁唑禾草靈用藥歷史有關(guān)。Neve等[17]研究發(fā)現(xiàn)，雜草群落內(nèi)本來(lái)就存在少數(shù)具有抗藥性基因的雜草，除草劑的持續(xù)選擇壓力使敏感性雜草數(shù)量不斷減少，而抗藥性雜草數(shù)量不斷增加并發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)雜草。

研究表明，ACCase的CT區(qū)域氨基酸發(fā)生突變是導(dǎo)致雜草對(duì)ACCase抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一[10]。本研究通過(guò)對(duì)耿氏硬草抗性和敏感種群ACCase基因部分片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)，結(jié)果顯示，抗性種群SD-23的ACCase第2 096位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楸彼?Gly-2 096-Ala)，這可能是SD-23種群對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗性的重要原因之一，該突變方式是第一次在耿氏硬草中被發(fā)現(xiàn)。Gly-2 096-Ala突變是于2005年在抗性大穗看麥娘中被首次報(bào)道[18]，隨后Scarabel等[19]在抗性黑麥草屬(Loliumspp.)中也檢測(cè)到該突變方式。認(rèn)為GIy-2096-Ala突變會(huì)導(dǎo)致雜草對(duì)APP類除草劑產(chǎn)生抗藥性，而對(duì)CHD類和PPZ類除草劑敏感。本研究通過(guò)整株水平法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，SD-23種群對(duì)炔草酯和精吡氟禾草靈產(chǎn)生了抗性，而對(duì)烯禾啶、烯草酮和唑啉草酯敏感，此結(jié)果與前人的研究相一致[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)，甲基二磺隆、啶磺草胺和異丙隆等除草劑對(duì)耿氏硬草抗性和敏感種群均有較好防效，因此這些除草劑可以作為防治抗ACCase抑制劑類除草劑耿氏硬草的重要選擇。長(zhǎng)期施用某單一作用靶標(biāo)類型的除草劑，極易導(dǎo)致雜草抗藥性的產(chǎn)生[20-21]。Beckie等[22]報(bào)道，不同作用機(jī)制的除草劑混用或輪用可以有效地延緩和治理產(chǎn)生交互抗性的雜草。

本研究初步明確了耿氏硬草抗性種群的靶標(biāo)抗性分子機(jī)制及其對(duì)不同除草劑的敏感性，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中合理選擇藥劑防除抗性耿氏硬草及延緩雜草抗藥性的發(fā)生具有重要指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)靶標(biāo)酶表達(dá)量和解毒代謝酶活性等方面進(jìn)行研究，因此不能排除其對(duì)抗性產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，這有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。