小麥RIL群體苗期抗旱性狀的QTL分析

滿君霞，張國華，徐加利，吳盼盼，韓 旭，趙 巖，李斯深

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018； 2.泰安市農(nóng)業(yè)局，山東泰安 271000； 3.濱州市農(nóng)業(yè)局，山東濱州 256600)

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，也是我國最重要的商品糧食和貯藏品種[1]。隨著全球變暖的加劇，干旱已成為世界性的熱點(diǎn)問題，嚴(yán)重制約著作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量提高[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上70%的小麥種植于干旱和半干旱地區(qū)[3]，嚴(yán)重限制小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)性[4]。我國小麥主要種植在降水少的北方地區(qū)，尤其在播種期間降水較少，經(jīng)常遇到土壤干旱，抑制小麥的萌發(fā)和出苗，最終引起小麥產(chǎn)量的降低，因此水分脅迫一直是影響我國北方小麥生產(chǎn)的主要因素之一[5]。提高小麥幼苗的耐旱性可以克服土壤干旱的影響，進(jìn)而為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[6]。

小麥抗旱性的鑒定指標(biāo)主要包括形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)以及抗旱系數(shù)、抗旱指數(shù)等綜合指標(biāo)[7-9]。一般抗旱系數(shù)值越大，品種的抗旱性越強(qiáng)[10]。小麥的抗旱性是由多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。苗期在干旱脅迫下的表現(xiàn)更為直觀，選育苗期抗旱性好的品種是提高小麥抗旱性的重要手段[11-13]。小麥苗期根系發(fā)育對其抗旱性有重要影響，苗期的根干重與抗旱性呈顯著正相關(guān)[7-8,14]。在干旱條件下，抗旱小麥品種的根系發(fā)達(dá)，根較長、根系入土深、根較重、根冠比高[15]。此外，小麥的苗高和芽鮮重也在一定程度上反映出品種的抗旱性[12]。

分子標(biāo)記技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展為從分子水平上研究作物抗旱機(jī)理提供了可能，發(fā)掘抗旱相關(guān)性狀 QTL，對開展小麥抗旱分子育種具有促進(jìn)作用。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)高滲溶液誘導(dǎo)滲透脅迫最為類似于自然干旱，簡單易行、周期短、受環(huán)境影響小，已被廣泛應(yīng)用于小麥[16]、水稻[17-18]等重要農(nóng)作物苗期的耐旱性鑒定。在模擬條件下研究作物的抗旱性能夠最大限度的消除大田環(huán)境下不可控環(huán)境條件的影響[10]。前人開展了許多苗期抗旱性狀的QTL分析。例如，周曉果等[15]以小麥DH家系為材料，在水分脅迫和非水分脅迫條件下，對最長根長、根鮮重、根干重、根莖鮮重比和根莖干重比等根系性狀進(jìn)行QTL定位，共檢測到11個(gè)加性效應(yīng)QTL和15對上位效應(yīng)QTL。張正斌等[19]對 33個(gè)與小麥水分利用效率有關(guān)的性狀進(jìn)行了QTL分析，在6A和 6B上發(fā)現(xiàn)控制根系的多個(gè)QTL簇。Landjeva等[20]在模擬的干旱條件下調(diào)查小麥水培幼苗的根長、苗高等性狀，共發(fā)現(xiàn)35個(gè)QTL。

由于不同研究所用的分析群體以及分子標(biāo)記圖譜不同，所得的結(jié)果也不盡相同，小麥抗旱性QTL還需要進(jìn)一步研究，因此，本研究以小麥“泰農(nóng)18×臨麥6號”RIL(Recombinant Inbred Lines)群體為材料，利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高密度遺傳圖譜[21]，在PEG-6000模擬干旱脅迫和正常供水兩種處理下，對苗期性狀及其抗旱系數(shù)進(jìn)行QTL分析，以期為小麥抗旱基因的克隆、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為 “泰農(nóng)18×臨麥6號”RIL群體(TL-RIL，包括184個(gè)家系)及其親本。泰農(nóng)18是本課題組選育的小麥品種，于2008年通過山東省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。臨麥6號是臨沂市農(nóng)科院選育的小麥品系。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行。采用水培法，試驗(yàn)設(shè)置PEG模擬干旱脅迫(D)和正常供水(CK)兩種處理，重復(fù)3次。進(jìn)行2次試驗(yàn)，時(shí)間分別為2012年10月19日至11月19日(記為D1，CK1)和2012年11月28日至12月28日(記為D2，CK2)。模擬干旱脅迫處理的平均值記為DAV，正常供水處理的平均值記為CKAV。小麥RIL群體各家系及其父母本種子經(jīng)過10%雙氧水消毒5 min后，用蒸餾水沖洗數(shù)次，放入培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幼苗(溫度為25 ℃，光照周期為12 h·d-1，相對濕度為60%～70%)。當(dāng)幼苗長到一葉一心時(shí)，挑選長勢健壯一致的幼苗，植于發(fā)芽盤中并用海綿固定，每個(gè)株系1穴，每穴2株，每株系3次重復(fù)共6株 。將發(fā)芽盤置于盛有20 L Hoagland 營養(yǎng)液的黑色塑料盒中，保持根系在黑暗環(huán)境中生長，用塑膠封住發(fā)芽盤周圍間隙，防止水分蒸發(fā)。培養(yǎng)1天后，以含有 19.2% PEG-6000 的Hoagland 營養(yǎng)液進(jìn)行模擬干旱脅迫處理(小麥抗旱性鑒定評價(jià)技術(shù)規(guī)范：GB/T 21121-2007)，正常供水處理則不加PEG。當(dāng)對照植株長到三葉期時(shí)測定相關(guān)性狀[15]。

1.3 抗旱性狀測定和抗旱系數(shù)計(jì)算

本試驗(yàn)調(diào)查以下性狀：苗高、最大根長、根數(shù)、苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重，每個(gè)性狀的表型值分別為3次重復(fù)的平均值。鮮重根冠比=根鮮重/苗鮮重；干重根冠比=根干重/苗干重。用兩次試驗(yàn)的平均值計(jì)算抗旱系數(shù)：抗旱系數(shù)=脅迫下性狀測定值的平均值/非脅迫下性狀測定值的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和QTL定位

利用“泰農(nóng)18×臨麥6號”RIL群體的高密度遺傳圖譜進(jìn)行QTL分析[21]，該圖譜包括 10 739個(gè)位點(diǎn)，其中獨(dú)立位點(diǎn) 5 399個(gè)(3 788個(gè)DArT、 1 506個(gè)SNP、105個(gè)SSR位點(diǎn))，總長 3 394.47 cM，平均密度0.63 cM/marker。QTL分析采用Icimapping 4.1軟件，步長為0.5 cM。LOD 的閾值通過置換檢測確定(permutation test)：命令在P=0.05 水平時(shí)使用 1 000次重復(fù)排列運(yùn)算后，確定為LOD≥3.8。

定義相對較高頻率QTL(relative high frequency QTL,RHF-QTL)為在D1、D2、DAV(或CK1、CK2、CKAV)中的兩個(gè)或兩個(gè)處理以上檢測到的QTL；因抗旱系數(shù)按平均值計(jì)算，因此抗旱系數(shù)QTL也看做RHF-QTL。定義在同一染色體置信區(qū)間重疊涉及到3個(gè)以上性狀QTL為QTL簇[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀

多數(shù)性狀在親本泰農(nóng)18(Tainong 18)和臨麥6號(Linmai 6)之間表現(xiàn)出明顯的差異，并且所有性狀在RIL群體中均出現(xiàn)超親分離(表1)，變異系數(shù)的范圍為6.73%～37.92%，多數(shù)性狀-環(huán)境的變異系數(shù)超過10%。遺傳力最大為 70.20%(苗高,CK)，最小為48.00%(干重根冠比,CK)；干旱脅迫處理下比正常水分處理下的遺傳力稍低。

2.2 QTL分析

利用本課題組創(chuàng)建的遺傳圖譜[21]，用 IciMapping完備區(qū)間作圖法[24]進(jìn)行QTL分析。結(jié)果表明，共檢測到43個(gè)QTL(58個(gè)單一性狀-環(huán)境組合QTL)(表2)，位于14條染色體(1A、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5B、6A、6B、7B、7D)。其中28個(gè)QTL為正值，表明QTL的增加效應(yīng)來自于母本泰農(nóng)18；30個(gè)QTL為負(fù)值，表明其增加效應(yīng)來自于父本臨麥6號。單一QTL可解釋3.39%～32.63%的表型變異，LOD最大值為52.88(鮮重根冠比)。上述QTL中，11個(gè)為在兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)處理下檢測到的高頻表達(dá)QTL(RHF-QTL)，1個(gè)簇位于4B染色體上 (表3)。

在兩種水分處理下均檢測到的QTL有10個(gè)，分布在1A、3A、4B、5B、7B染色體上，其中有8個(gè)QTL(QSh-4B-1、QMrl-D-3A-2、QRn-D-5B-2、QSfw-4B-1、QSfw-4B-1、QRsfw-4B-1、QRsfw-D-4B-1、QRsdw-4B-1.1)的貢獻(xiàn)率均大于10%。只在干旱脅迫下檢測到的QTL有18個(gè)，分布在1D、2D、3A、3B、4A、4B、6A、7D染色體上，其中有6個(gè)QTL(QSh-3B-2.2、QMrl-4A-1、QSfw-6A-3、QRfw-6A-2.1、QRsfw-7D-1.2、QRsdw-4B-1.2)的貢獻(xiàn)率大于10%。僅在正常水分處理下檢測到的QTL有15個(gè)，分布在1A、1D、2A、2B、3B、4A、6B染色體上，其中有4個(gè)QTL(QMrl-3B-3.1、QSh-2B-2.1、QSh-2B-2.2、QRn-6B.2)的貢獻(xiàn)率大于10%。

2.2.1 形態(tài)性狀的QTL

苗高(SH)：共檢測到5個(gè)QTL，分布在2B(2個(gè)QTL)、3B(2個(gè)QTL)、4B染色體，可解釋6.71%～30.32%的表型變異。其中QSh-4B-1的平均貢獻(xiàn)率為23.37%，在兩種水分處理下均能檢測到，是主效RHF-QTL，增加QTL效應(yīng)來自臨麥6號。

最大根長(MRL)：共檢測到5個(gè)QTL，分布在1D、3B(2個(gè)QTL)、4A、6B染色體上，可解釋6.21%～12.10%的表型變異。其中，QMrl-3B-3.1的平均貢獻(xiàn)率為11.42%，在兩種處理下均能檢測到，是RHF-QTL，增加QTL效應(yīng)來自臨麥6號。

表1 RIL群體及其親本的性狀表現(xiàn)Table 1 Phenotypic performance for investigated traits of the RILs and their parents

(續(xù)表1 Continued table 1)

性狀Trait處理Treatment親本 Parent泰農(nóng)18Tainong 18臨麥6號Linmai 6RIL(n=184)平均值A(chǔ)V最小值MIN最大值MAX標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)CV/%遺傳力Heritability/%DAV0.36 0.41 0.35 0.22 0.45 0.04 10.36 50.00 CK10.21 0.27 0.20 0.09 0.29 0.03 14.79 CK20.79 0.38 0.60 0.14 1.18 0.23 37.92 CKAV0.50 0.32 0.40 0.18 0.71 0.11 28.22 48.00 SH-D0.85 0.77 0.82 0.68 0.98 0.06 6.73 MRL-D0.99 1.06 0.98 0.79 1.21 0.08 8.11 RN-D1.15 1.07 1.17 0.83 1.86 0.17 14.52 SFW-D0.47 0.51 0.45 0.26 0.70 0.07 16.32 RFW-D1.02 1.12 1.03 0.67 1.64 0.19 18.72 SDW-D0.76 0.80 0.73 0.45 1.23 0.14 19.47 RDW-D1.20 1.28 1.11 0.70 1.88 0.21 19.08 RSFW-D2.33 2.30 2.42 1.56 3.85 0.29 12.02 RSDW-D0.72 1.28 0.96 0.49 2.23 0.29 30.16

SH：苗高；MRL：最大根長；RN：根數(shù)；SFW：苗鮮重；RFW：根鮮重；SDW：苗干重；RDW：根干重；RSFW：鮮重根冠比；RSDW：干重根冠比。性狀-D：該性狀的抗旱系數(shù)；D1、CK1：2012年10月19日至11月19日進(jìn)行的PEG脅迫處理(D1)和非脅迫處理(CK1)；D2、CK2：2012年11月28日至12月28日進(jìn)行的PEG脅迫處理(D2)和非脅迫處理(CK2)； DAV、CKAV：兩次脅迫處理的平均值(DAV)和兩次非脅迫處理的平均值(CK2)。下同。

SH:Shoot height; MRL:Maximum root length; RN:Root number; SFW:Shoot fresh weight; RFW:Root fresh weight; SDW:Shoot dry weight; RDW:Root dry weight; RSFW:Root-shoot ratio in fresh weight; RSDW:Root-shoot ratio in dry weight.Trait-D:Drought resistance coefficient of corresponding traits;D1and CK1:PEG stress treatment(D1) and non-stress treatment(CK1) from October 19 to November 19,2012; D2and CK2:PEG stress treatment(D2) and non-stress treatment(CK2) from November 28 to December 28,2012; DAVand CKAV:Mean value of two stress treatments(DAV) and average of two non-stress treatments(CK2).The same below.

根數(shù)(RN)：共檢測到9個(gè)QTL，分布在1A(2個(gè)QTL)、1D、2A、3B、4A(2個(gè)QTL)、6B(2個(gè))染色體，可解釋3.39%～14.07%的表型變異，無RHF-QTL 。

苗鮮重(SFW)：共檢測到3個(gè)QTL，分布在1D、4B、6A染色體，可解釋7.39%～17.16%的表型變異。QSfw-4B-1的平均貢獻(xiàn)率為15.37%，在兩種水分處理下均能檢測到，是主效RHF-QTL，增加QTL效應(yīng)來自臨麥6號。

根鮮重(RFW)：共檢測到6個(gè)QTL，分布在2D、3A、4A、4B、6A(2個(gè)QTL)染色體上，可解釋 5.08%～10.65%的表型變異。

苗干重(SDW)：共檢測到1個(gè)QTL，位于4B染色體，QSdw-4B-1的平均貢獻(xiàn)率為13.42%，在兩種水分處理下均能檢測到，是主效RHF-QTL，增加QTL效應(yīng)來自臨麥6號。

根干重(RDW)：共檢測到3個(gè)QTL，分布在2D、3B、4A染色體上，可解釋6.49%～9.52%的表型變異。

鮮重根冠比(RSFW)：共檢測到3個(gè)QTL，分布在4B、7D(2個(gè)QTL)染色體，可解釋 3.99%～32.63%的表型變異。QRsfw-4B-1的平均貢獻(xiàn)率為23.88%，在兩種水分處理下均能檢測到，是主效RHF-QTL，增加QTL效應(yīng)來自泰農(nóng)18。

干重根冠比(RSDW)：共檢測到3個(gè)QTL，分布在3B、4B(2個(gè)QTL)染色體，可解釋 9.77%～25.02%的表型變異。

2.2.2 抗旱系數(shù)的QTL

所有9個(gè)性狀的抗旱系數(shù)中，僅檢測到3個(gè)性狀抗旱系數(shù)的QTL。

最大根長抗旱系數(shù)(MRL-D)：共檢測到3個(gè)QTL，分布在1A、3A、7B染色體，可解釋 6.45%～10.38%的表型變異。

根數(shù)抗旱系數(shù)(RN-D)：共檢測到1個(gè)QTL (QRn-D-5B-2)，位于5B染色體上，貢獻(xiàn)率為 12.80%，增加效應(yīng)來自泰農(nóng)18。

鮮重根冠比抗旱系數(shù)(RSFW-D)：共檢測到1個(gè)QTL(QRsfw-D-4B-1)，位于4B染色體上，貢獻(xiàn)率為12.97%，增加效應(yīng)來自臨麥6號。

表2 不同水分處理下的抗旱性狀QTL定位Table 2 QTLs for drought resistance related traits detected in different drought treatments using the RILs

2.3 QTL簇分析

本研究中，在4B染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)QTL簇，包括4個(gè)形態(tài)性狀的QTL(QSh-4B-1、QSfw-4B-1、QSdw-4B-1、QRsfw-4B-1)和1個(gè)抗旱系數(shù)QTL(QRsfw-D-4B-1)。這5個(gè)QTL的平均貢獻(xiàn)率較高，變化范圍為12.97%～20.69%，是主效RHF-QTL。QRsfw-4B-1的增加效應(yīng)來自泰農(nóng)18，其他4個(gè)QTL增加效應(yīng)均來自臨麥6號(表3)。

表3 不同水分處理下的抗旱性狀QTL簇Table 3 QTL Clusters of drought resistance related traits under different drought treatments

3 討 論

小麥的抗旱性是由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，是小麥本身的遺傳特性和環(huán)境共同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)以PEG-6000模擬干旱脅迫，在很大程度上可以消除環(huán)境的干擾。在以往的研究中，已經(jīng)定位到許多關(guān)于小麥苗期抗旱性狀的QTL[6,15]。Zhang 等[6]在染色體4B上定位到一個(gè)控制株高的QTL，本研究在4B染色體上也定位到1個(gè)控制苗高的QTL，貢獻(xiàn)率為23.37%，從系譜分析，這個(gè)QTL可能與rht-B1基因有關(guān)。周曉果等[15]在6B染色體上定位到控制最大根長的QTL，本研究在6B染色體上也定位到一個(gè)控制最大根長的QTL，可解釋6.54%的表型變異。由于不同研究者利用的群體和標(biāo)記類型不同，難以根據(jù)分子標(biāo)記進(jìn)行詳細(xì)比較，本研究的大多數(shù)QTL定位在新的分子標(biāo)記區(qū)間。

多個(gè)QTL定位在染色體同一區(qū)域形成QTL簇，前人在小麥中發(fā)現(xiàn)了許多QTL簇[23,25-26]。本研究在4B染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)QTL簇，包括4個(gè)形態(tài)性狀的QTL(QSh-4B-1、QSfw-4B-1、QSdw-4B-1、QRsfw-4B-1)和1個(gè)抗旱系數(shù)QTL (QRsfw-D-4B-1)。Yuan等[26]利用該RIL群體進(jìn)行了苗期和成株期P效率相關(guān)性狀的QTL分析，在該區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)QTL簇(C5)，包括SDW(苗干重)、TDW(植株總干重)、RSDW(干重根冠比)、SPUTE(苗期P利用效率)、SN(單位面積穗數(shù))、GWP(單株粒重)、GPTUE(籽粒的P利用效率)的QTL。這表明該區(qū)域不但與抗旱相關(guān)，而且與P利用效率性狀相關(guān)。該區(qū)間覆蓋的標(biāo)記(D-3022151～D-4008856)可以用作標(biāo)記輔助選擇。