小麥丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶基因( TaAGT2)的克隆、 生物信息學(xué)預(yù)測及表達(dá)分析

吳 凡，徐德芳，宋少帥，李超卿，穆 平

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島 266109； 2.東營市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東東營 257091)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國干旱半干旱地區(qū)種植的主要農(nóng)作物。干旱會影響小麥的生長發(fā)育，限制其產(chǎn)量的提高[1]。在植物生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到惡劣環(huán)境的影響，如干旱、鹽漬、低溫等，其中干旱是各種非生物脅迫中對植物損害最嚴(yán)重的因素，直接影響植物的生長及產(chǎn)量。植物在長期進(jìn)化的過程中，形成了復(fù)雜的脅迫響應(yīng)機(jī)制，以適應(yīng)干旱環(huán)境。這種機(jī)制不僅包括形態(tài)結(jié)構(gòu)如葉片和根系的變化調(diào)節(jié)[2]；生理和生化水平的調(diào)節(jié)，如植物的光合作用、光呼吸、氮代謝、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等；還有分子水平的調(diào)控，如抗旱基因的表達(dá)、逆境相關(guān)蛋白的合成等[3-4]。

研究表明，光呼吸是光合作用的補(bǔ)充反應(yīng)，可以消耗體內(nèi)的乙醛酸，減少其對細(xì)胞的傷害，是植物生長發(fā)育過程中為抵御不良環(huán)境、提高抗逆性等形成的一種反應(yīng)途徑[5]。在植物進(jìn)行光呼吸代謝時，乙醛酸會在轉(zhuǎn)氨酶(甘氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶)的催化作用下生成甘氨酸[6]，甘氨酸進(jìn)入線粒體后在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成絲氨酸，過量的絲氨酸會循環(huán)進(jìn)入過氧化物酶體，在絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SGAT)的作用下，進(jìn)入葉綠體中參與卡爾文循環(huán)，由此可見植物光呼吸的過程離不開轉(zhuǎn)氨酶(aminotransferase，transaminase)的催化作用。轉(zhuǎn)氨酶是存在于生物體內(nèi)的催化劑，在氨基酸的代謝中起到重要作用，在不同的氨基酸供體和中間物存在的條件下，催化氨基酸與酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移，生成一種新的氨基酸，從而實現(xiàn)催化氨基酸的合成和降解的作用， 其反應(yīng)是可逆的[7]。植物絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SGAT)與谷氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GGAT)主要催化乙醛酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng),是光呼吸途徑中的兩種關(guān)鍵酶。此外，甘氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶可以催化丙氨酸-乙醛酸反應(yīng)、絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)以及絲氨酸-丙酮酸鹽代謝過程[8]，在植物光呼吸過程中也發(fā)揮著重要作用。

本研究基于抗旱小麥品種青麥6號的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析所得差異表達(dá)基因，篩選與轉(zhuǎn)氨酶有關(guān)的差異表達(dá)基因，從中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)氨酶——丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine-glyoxylate aminotransferase，AGT)，通過查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在人和動物中均報道過丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶，而植物中的丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶未見報道。由于丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶是一種轉(zhuǎn)氨酶，所以推測其可能參與植物光呼吸的某個過程。為了進(jìn)一步探索編碼丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶基因的功能，本研究通過RACE技術(shù)獲得小麥中一個編碼丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的基因序列，將其命名為TaAGT2，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，以期為后續(xù)基因功能研究和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以小麥品種青麥6號為試驗材料。挑選大小一致、飽滿的青麥6號種子200粒，用75%的乙醇消毒1 min，置于鋪有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，在光照培養(yǎng)箱(25 ℃/15 ℃；16 h光照，8 h黑暗；250 μmol·m-2·s-1)內(nèi)培養(yǎng),種子萌發(fā)7 d左右，將幼苗轉(zhuǎn)置于盛放Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒，每3天換1次營養(yǎng)液。當(dāng)幼苗長至兩葉一心時，選擇長勢一致的植株分別進(jìn)行低溫(4 ℃)、脫落酸(100 μmol·L-1ABA)、干旱(20% PEG)和高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理，每個處理3次重復(fù)。分別在不同脅迫處理的0、3、6、12、24、48和72 h采集幼苗，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

總RNA提取按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(賽恩斯,中國山東)說明書進(jìn)行[9]。提取后的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；用紫外分光光度計在波長260 nm和280 nm處測吸光值，檢測RNA的純度。將純度高且完整性好的RNA,按照SMARTerRACE 5′/3′Kit(賽恩斯，中國山東)說明書合成3′RACE-Ready cDNA。將符合質(zhì)量要求的RNA,按照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(諾唯贊，中國南京)說明書合成cDNA用于后續(xù)實時熒光定量PCR。

1.3 TaAGT2基因的克隆

1.3.1TaAGT2基因的3′RACE擴(kuò)增

根據(jù)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到的編碼丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶基因的不完整序列，用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計3′RACE 的特異性引物和巢式 PCR 反應(yīng)的特異性引物。利用特異性引物OUTAGT2、通用引物 UPM 和 3′RACE -Ready cDNA進(jìn)行第一步 PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系與程序參考說明書。將第一步 PCR 產(chǎn)物稀釋 50 倍,進(jìn)行巢式PCR 反應(yīng)，所用引物為INAGT2[10]。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收后,與pEAST-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α(諾唯贊，中國南京)，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，送由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.2TaAGT2基因的全長克隆

為獲得TaAGT2基因的開放閱讀框，設(shè)計特異性引物AGT2-F和AGT2-R(表1)，利用高保真酶2×PhantaMax Master Mix(諾唯贊，中國南京)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系與程序參考說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為62 ℃，延伸時間為1.5 min 。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，克隆載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定后測序，具體參照1.3.1。

1.4 TaAGT2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用NCBI-ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對測序結(jié)果進(jìn)行蛋白編碼框預(yù)測，并將其翻譯成氨基酸序列。通過NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析，包括TaAGT2基因編碼蛋白的分子式、分子量、理論pI值及氨基酸組成等；用CBS-TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)和CBS-Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)和信號肽；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和ExPASy-SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測及分析蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)。用在線分析工具Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。用DNAMAN 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列分析。用MEGA6.0軟件生成NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 實時熒光定量PCR檢測 TaAGT2的表達(dá)

以小麥不同脅迫處理的cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參基因，用特異性引物TaAGT2-F和TaAGT2-R(表1)，在CFX96型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量分析。qRT-PCR體系和程序按照ChamQTMSYBRColor qPCR Master Mix(諾唯贊,中國南京)說明書進(jìn)行，每個樣品重復(fù)3次，目的基因的相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算[11]。通過SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaAGT2基因的克隆結(jié)果

以3′RACE-Ready cDNA為模板，通過引物OUTAGT2、INAGT2和3′UPM引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到基因的3′序列，與轉(zhuǎn)錄組測序所得序列拼接得到基因TaAGT2全長cDNA序列，再通過特異性引物AGT2 F和AGT2 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1。切膠回收后，與pEAST-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α(諾唯贊，中國南京)，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后送由公司測序。經(jīng)NCBI ORF Finder分析，所得序列的ORF長1 434 bp，編碼477個氨基酸。

表1 本研究所用引物的基本信息Table 1 Primers used in this study

2.2 TaAGT2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 TaAGT2蛋白的理化性質(zhì)

ExPASy-ProtParam在線預(yù)測蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，TaAGT2蛋白的分子式為C2288H3601N633O665S18，分子量為51.2 kDa，理論等電點(pI)8.13，為堿性蛋白。其氨基酸組成如表2，含量最高的氨基酸是丙氨酸 (12.2%)，含量最低的是色氨酸(0.4%)。帶負(fù)電的殘基總數(shù)(Asp + Glu)47個，帶正電的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為49個。該蛋白的理論半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為28.46，為穩(wěn)定型蛋白，脂肪系數(shù)為86.98，平均親水性為 -0.053，表明該蛋白總體上親水性和疏水性接近平衡。

M：DL2000 DNA Marker；1：AGT2 F/AGT2 R的擴(kuò)增產(chǎn)物。

M: DL2000 DNA Marker; 1: Amplified products of primer AGT2 F/AGT2 R.

圖1TaAGT2基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 Electropherogram of PCR product of geneTaAGT2

表2 TaAGT2蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of TaAGT2 protein

2.2.2TaAGT2基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)和信號肽及結(jié)構(gòu)

通過Cell-PLoc 2.0在線軟件對TaAGT2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示：TaAGT2蛋白定位于線粒體。CBS-TMHMM和CBS-SignalP 在線預(yù)測表明，該蛋白無任何跨膜區(qū)域，且不存在信號肽，由此推測TaAGT2不是分泌蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，TaAGT2 蛋白中含有保守結(jié)構(gòu)域 OAT。此結(jié)構(gòu)域為AAT- I超家族所共有，推測該蛋白是 AAT- I 家族成員。用SOPMA在線工具對AGT2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白包括42.14%的α螺旋(Alpha helix )、16.98%的延伸鏈(extended strand)、7.97%的β轉(zhuǎn)角(Beta turn)和32.91%的無規(guī)則卷曲(random coil)。用ExPASy-SWISS-MODEL對蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白的三級結(jié)構(gòu)多為α螺旋和無規(guī)則卷曲。

2.2.3 TaAGT2 蛋白質(zhì)的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將TaAGT2基因編碼的氨基酸序列在NCBI-BlastP蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)其與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon： XP_003568249.1)、水稻(Oryzasativa：XP_015639493.1)、高粱(Sorghumbicolor：XP_002441258.1)、谷子(Setariaitalica：XP_004961760.1)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschiisubsp：XP_020198627.1 )、玉米(Zeamays：PWZ16817.1)等禾本科植物的氨基酸序列相似性在80%～94%之間，表明TaAGT2蛋白在禾本科植物中具有較強(qiáng)的保守性(圖2)。利用MEGA6.0對以上氨基酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖3可知，TaAGT2蛋白與小麥近緣物種節(jié)節(jié)麥的AGT基因及二穗短柄草的AGT基因位于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，可能具有相同的起源。

圖2 TaAGT2蛋白的氨基酸序列比對分析Fig.2 Alignment analysis of TaAGT2 amino acid sequence

圖3 TaAGT2蛋白與一些禾本科及其他植物AGT2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of TaAGT2 protein and some AGT2 amino acid sequences of gramineae and other plants

2.3 TaAGT2基因的表達(dá)特性分析

從圖4可以看出，基因TaAGT2在小麥根、莖和葉中均有表達(dá),但在不同組織中的表達(dá)有差異，在莖中的表達(dá)量最高，顯著高于根和葉，推測基因TaAGT2主要在莖中表達(dá)。

從圖5可以看出，在4種非生物脅迫條件下，小麥幼苗中基因TaAGT的表達(dá)均發(fā)生了明顯的變化。在4 ℃低溫脅迫下，TaAGT2的表達(dá)量隨著脅迫時間的延長而升高，72 h時表達(dá)量最大，為對照的44.02倍。ABA脅迫下，處理3 h時達(dá)到最高點，為對照的6.8倍，6～12 h有所下降，24 h再次上升，48～72 h又出現(xiàn)下降，但TaAGT2的相對表達(dá)量總體上均高于對照。干旱脅迫6 h，TaAGT2表達(dá)量為對照的2.24倍， 12～24 h有所下降，48 h的表達(dá)量有所回升，72 h再次下降。在鹽脅迫3 h時，TaAGT2達(dá)到對照的5.2倍，在隨后的脅迫時間內(nèi)表達(dá)量下降。以上結(jié)果表明，基因TaAGT2參與了4種非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，是作用廣泛的脅迫應(yīng)答基因，而不是在某種脅迫條件下特異表達(dá)的基因。干旱、低溫、ABA和高鹽這4種非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間有一定的聯(lián)系，同時也表明植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)受復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)成為探索和研究生物奧秘的主要手段，其中最受研究者歡迎的就是轉(zhuǎn)錄組學(xué)[12]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)是一種高通量、高準(zhǔn)確性、高效率和低成本的測序技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組即一個活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個重要手段，也是挖掘一些與重要生理功能相關(guān)基因，揭示基因表達(dá)和調(diào)控規(guī)律的有效方法[13]。本研究就是基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過GO和KEGG分析差異顯著基因，從中篩選出了一系列與轉(zhuǎn)氨酶有關(guān)的基因，最終以編碼丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的基因作為候選基因，進(jìn)行基因克隆及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步驗證候選基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters above the columns indicate significant difference(P<0.05).

圖4TaAGT2在小麥不同組織間的差異表達(dá)

Fig.4Differential expression ofTaAGT2in different tissues of wheat

圖柱上字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters above the columns indicate significant difference(P<0.05).

圖5TaAGT2基因在不同脅迫處理下的表達(dá)差異

Fig.5 Differential expression ofTaAGT2gene under different stress treatments

cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)由Frohman等[14]于1988年首次提出，是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5′和3′末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優(yōu)勢而受到越來越多的重視。另外，由于RACE的敏感性高，特別適合于對低拷貝數(shù)基因的獲得，因此，成為克隆未知基因全長cDNA序列的常用手段。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展，使人們對植物抗逆的分子機(jī)理有了進(jìn)一步的認(rèn)識。利用生物信息學(xué)分析，可以從測序數(shù)據(jù)中預(yù)測可能的抗性基因，從而指導(dǎo)人們發(fā)現(xiàn)和鑒定這些基因。本研究通過RACE技術(shù)從小麥中克隆了丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(TaAGT2),該基因具有完整的開放閱讀框，多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其與多種植物的丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶相似，被預(yù)測定位于線粒體中，可能與光呼吸中的乙醛酸代謝途徑有關(guān)，乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶是光呼吸途徑中催化乙醛酸生成甘氨酸的轉(zhuǎn)氨酶，因此推測TaAGT2基因編碼的蛋白可能參與了光呼吸途徑。

光呼吸是植物體內(nèi)重要的代謝過程，越來越多的研究表明，光呼吸途徑可以提高植物的抗逆性和抗病性[15-17]，可能是由于編碼光呼吸途徑中關(guān)鍵酶的基因，參與了植物對生物及非生物脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)，但具體的調(diào)控機(jī)制還需要深入探究。如大豆中編碼絲氨酸/丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶基因(GmSAGT1)的表達(dá)與大豆霜霉病抗性密切相關(guān)[18]。干旱脅迫下植物中與光合作用相關(guān)的酶活性下降，而與光呼吸相關(guān)的酶如煙草中的乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的活性不受影響，甚至有的酶活性上升[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在絲氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶酶促反應(yīng)的上游，乙二醇經(jīng)乙醇酸氧化酶的催化反應(yīng)生成了乙醛酸和過氧化氫(H2O2)[20]，可以將H2O2作為植物抵抗逆境的信號物質(zhì)[21]，為進(jìn)一步研究基因TaAGT2的功能提供了依據(jù)。