遺傳性血色病的實驗室診斷

鄭林文

【摘要】目的：探討遺傳性血色病的臨床特點，評價血清鐵指標(biāo)、MRI、肝穿病理學(xué)檢查在遺傳性血色病診斷中的作用，并對遺傳性血色病的相關(guān)疾病基因HFE進(jìn)行突變分析。方法：患者，女。因肝功異常就診，進(jìn)行臨床、血清鐵指標(biāo)、胸腹部MRI、病理組織學(xué)和特殊染色的觀察，并通過PCR及DNA序列測定等方法對與該病相關(guān)的HFE基因進(jìn)行分析。結(jié)果：轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、鐵蛋白異常;肝穿病理檢查，肝鐵沉積過多;胸腹部MRI顯示肝臟有金屬沉積;該病相關(guān)的HFE基因突變位點有待進(jìn)一步查找。結(jié)論：遺傳性血色病患者在我國較少見，臨床特點不明顯，診斷困難，尤其是遺傳性血色病早期患者更難診斷，通過分子生物學(xué)方法診斷該病將變得更為重要。以上探討為該病的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】遺傳性血色病;HFE基因;MRI;肝臟;診斷

遺傳性血色病最先在1935年由Sheldon系統(tǒng)描述，其癥狀常在成年后才表現(xiàn)出來，且無特異性，診斷較困難。其診斷方法仍然主要依賴患者的臨床表現(xiàn)，包括臨床起病特點、多實質(zhì)臟器功能損害的臨床表現(xiàn)等以及家族史、有無近親婚配史、遺傳方式、影像學(xué)檢查和機體鐵負(fù)荷程度檢測（尤其是血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、鐵蛋白水平和肝鐵含量測定）。Feder等（1996）把遺傳性血色病基因限定在多態(tài)性位點D6S2238和D6S2241之間的240kb的范圍內(nèi)，并在該區(qū)域內(nèi)克隆了遺傳性血色病基因全長CDNA，鑒于遺傳性血色病基因與HLA家族基因具有較高的同源性，故把遺傳性血色病基因命名為HLA-H基因，且發(fā)現(xiàn)遺傳性血色病基因突變是本病患者發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。患者通過臨床診斷為遺傳性血色病，為了找到該病的基因突變?yōu)辄c，根據(jù)文獻(xiàn)報道和研究發(fā)現(xiàn)HFE基因變異是遺傳性血色病的主要發(fā)病原因，故從HFE基因入手進(jìn)行篩查。

1資料與方法

1.1一般資料

患者，女，22歲，有一妹17歲患糖尿病夭折，因肝功異常就診。從患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、機體鐵負(fù)荷程度檢測（尤其是血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、鐵蛋白水平和肝鐵含量測定）等各方面進(jìn)行診斷。其皮膚黏膜色素有沉著，經(jīng)鐵生化指標(biāo)檢測、MRI及肝穿診斷為遺傳性血色病。

遺傳性血色病的診斷標(biāo)準(zhǔn)：

（1）排除引起繼發(fā)性血色病（溶血性貧血、多次大量輸血、慢性肝病等）的疾病;

（2）參照美國肝病學(xué)會關(guān)于遺傳性血色病診治指南的建議：存在遺傳性血色病的癥狀或體征，和（或）鐵生化指標(biāo)異常;肝穿病理學(xué)檢查證實鐵的沉積或腹部磁共振（MRI）證實肝臟大量鐵沉積;

（3）結(jié)合遺傳病學(xué)家系調(diào)查。

1.2方法

（1）患者檢查血清鐵（SD、血清鐵蛋白（SF）、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（TS）、血常規(guī)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和血糖。行肝穿病理學(xué)檢查，肝組織行HE染色，并做了腹部MRI、CT和彩色B超。

（2）采用碘化鉀法提取外周靜脈血白細(xì)胞DNA。設(shè)計6對PCR引物（上海生工公司合成），擴增HFE基因6個外顯子，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃，30s;55℃，30s;72℃，30s;共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5u1在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，100伏電壓下電泳40分鐘后，用Fluor-S凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，看電泳條帶是否與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物按常規(guī)在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，此時應(yīng)保證電泳緩沖液為新鮮配置的，100伏電壓下電泳40分鐘后，在紫外燈下切下含預(yù)期區(qū)帶的凝膠塊，用上海生工公司的膠回收試劑盒回收DNA。PCR產(chǎn)物純化后，以相應(yīng)引物，委托上海生工公司在ABI PRISM 3730上進(jìn)行DNA序列測定。

2結(jié)果

（1）患者血清鐵（SI）、血清鐵蛋白（SF）、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度（TS）均偏高。

（2）肝臟穿刺術(shù)，肝臟病理回報：肝小葉結(jié)構(gòu)局灶存在，局灶紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的高密度脂褐素沉積，其中可見細(xì)小顆粒狀物質(zhì)，有的顆粒彌漫分布，有的聚集成堆，有時可見單位膜包繞，脂褐素主要集中在毛細(xì)膽管附近，部分肝細(xì)胞脂滴存在，肝細(xì)胞核及其他細(xì)胞器無明顯異常竇間隙內(nèi)及小葉間纖維組織增生無炎癥細(xì)胞浸潤。送檢的組織中間2個匯管區(qū)明顯增大，纖維組織增生，弓形纖維形成，少許炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)合臨床及電鏡超微結(jié)構(gòu)特點診斷血色病伴肝纖維化。

（3）腹部MR/和彩色超聲診斷。

超聲所見：肝臟形態(tài)正常，左肝大小10.24x3.64cm，右肝肋間厚約11.56cm，實質(zhì)回聲，肝門處探及多個實性偏低回聲區(qū)，較大約1.53x1.20cm，邊界清，膽囊，胰腺，脾臟正常。

超聲診斷：肝門處多發(fā)實性腫塊，考慮腫大淋巴結(jié)，肝、膽、胰、脾未見異常。

磁共振（上腹部）肝臟大小形態(tài)正常，左右肝比例正常，邊沿光整，肝內(nèi)信號普遍下降，于T1WI及T2WI上均呈低信號尚均勻，增強掃描普遍無強化，肝門區(qū)有輕度片狀強化（此兩處強化可能為正常的肝島），提示有重金屬類沉積。

（4）腹部CT顯示肝臟有高密度物質(zhì)沉積。

（5）瓊脂糖凝膠電泳分析片斷大小。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳時，出現(xiàn)特異性區(qū)帶分別為：El：300bp;E2：396bp;E3：500bp;E4：390bp;E5：348bp;E6：220bp，與預(yù)期大小相符

（6）序列比對分析結(jié)果。應(yīng)用PCR及測序方法對一例遺傳性血色病家系先證者的HFE基因進(jìn)行突變分析，在其HFE基因全長編碼區(qū)均未發(fā)現(xiàn)突變位點

3討論

遺傳性血色病在西方國家常見，近年來，隨著HFE基因、HJV基因、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2（TfR2）、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（FPI）和鐵調(diào)素的相繼發(fā)現(xiàn)，遺傳性血色病的相關(guān)研究獲得突破性進(jìn)展。遺傳性血色病可能在白種人中是最常見的常染色體隱性遺傳性疾病。以上資料結(jié)果顯示，該名患者應(yīng)考慮遺傳性血色病的可能，一旦遺傳性血色病診斷明確，應(yīng)詳細(xì)詢問家族史，及時行家系篩查，并爭取早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。遺傳性血色病采用的放血治療，并不為早期患者所接受。鐵螯合劑療效有限，毒性較大，價格貴。隨著人們對鐵代謝生理機制認(rèn)識的深入。新型祛鐵藥物將會更好地為HHC患者服務(wù)。

分子診斷不僅可以確定患者的基因突變位點、突變類型、氨基酸改變情況和患者家系其他成員的基因型，還可以為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。本研究從基因組DNA途徑入手，應(yīng)用PCR及測序方法對一例遺傳性血色病家系先證者的HFE基因進(jìn)行突變分析，在其HFE基因全長編碼區(qū)均未發(fā)現(xiàn)突變位點。進(jìn)一步驗證了TsuiWM和Koyama C等人的觀點。根據(jù)國內(nèi)外研究資料，還需要從其他的遺傳性血色病相關(guān)基因上去尋找突變位點。一定規(guī)模的HHC相關(guān)基因的調(diào)節(jié)也是迫切需要盡早開展的。這樣的研究可以使我們能較為清晰地了解我國HHC疾病的發(fā)生率及相關(guān)基因突變類型，有利于開展更為深入的治療學(xué)研究。