2013-2018年北京市志賀菌藥物敏感性狀況研究

呂冰 田祎 張新 黃瑛 王全意 曲梅

細(xì)菌性痢疾是由志賀菌屬病原菌感染引起的一種常見腸道傳染病，志賀菌對人群普遍易感，嚴(yán)重影響人類健康。在發(fā)展中國家，菌痢是五歲以下兒童死亡的重要原因之一[1]。2005年8月，衛(wèi)生部發(fā)布《全國細(xì)菌性痢疾監(jiān)測方案(試行)》，依據(jù)該方案，北京市將志賀菌監(jiān)測納入常規(guī)監(jiān)測范疇。十余年的監(jiān)測結(jié)果顯示，宋內(nèi)志賀菌已經(jīng)成為北京市痢疾病原菌的優(yōu)勢菌株[2]，并且其耐藥率一直處于較高水平[3]。本研究收集了2013-2018年痢疾監(jiān)測工作中分離到的志賀菌，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，確定是否為產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamases，ESBLs) 菌株，并且對ESBLs菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測其耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)，了解北京市近2013-2018年志賀菌藥物敏感性流行情況。

1 材料與方法

1.1菌株來源 根據(jù)《國家霍亂痢疾監(jiān)測方案北京實(shí)施辦法》以及《北京市痢疾及其它感染性腹瀉監(jiān)測與疫情處置工作方案》，北京市16區(qū)均為監(jiān)測點(diǎn)，每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)選取1～2家有一定工作基礎(chǔ)的醫(yī)院作為監(jiān)測醫(yī)院腸道門診，每年4-10月每月完成40份病人糞便樣本的檢測，其他月份完成10～20份糞便標(biāo)本的檢測，并上送分離到的病原菌，由各區(qū)疾控中心進(jìn)行鑒定，菌株鑒定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)依據(jù)國家診斷標(biāo)準(zhǔn)《細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)WS287-2008 附錄A》，鑒定血清為日本生研志賀菌鑒定血清。

1.2藥物敏感性試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(Clinical and Laborary Standards Institute, CLSI)推薦的最小抑菌濃度法(minimal inhibitory concentration, MIC)。藥敏試驗(yàn)應(yīng)用上海星佰生物技術(shù)有限公司提供的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，應(yīng)用的藥物有：環(huán)丙沙星、氨芐西林、氯霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萘啶酸、阿莫西林-克拉維甲酸、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶-克拉維酸。其結(jié)果與CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：第26版》比較，以大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.3產(chǎn)ESBLs菌株的表型確證實(shí)驗(yàn) 參照CLSI推薦的頭孢噻肟、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶-克拉維酸MIC法的確證實(shí)驗(yàn)鑒定產(chǎn)ESBLs的志賀菌。與克拉維酸聯(lián)合的藥物MIC相對單獨(dú)藥物的MIC減低≥3個(gè)倍比稀釋度，即確定為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.4產(chǎn)ESBLs相關(guān)基因位點(diǎn)檢測及基因型分析 采用裂解法提取志賀菌DNA作為模板，參照文獻(xiàn)合成TEM型、SHV型、OXA型、CTXM型的ESBLs編碼基因特異性引物，引物序列見表1,引物序列來自于參考文獻(xiàn)[4-6]。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括雙蒸水9 μL、2×緩沖液12.5 μL、10 μmol/L引物各0.5 μL、DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)試劑均購自北京擎科新業(yè)生物有限公司，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成PCR產(chǎn)物的測序，測序結(jié)果在NCBI提供的數(shù)據(jù)庫中比對。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0分析菌株耐藥結(jié)果以及耐藥相關(guān)基因攜帶率等。

表1 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因引物合成序列

2 結(jié)果

2.1菌株血清分型鑒定結(jié)果 2013-2018年，共收集266株志賀菌，其中,2013年72株，2014年96株，2015年66株，2016年24株，2017年6株，2018年2株。266株志賀菌中宋內(nèi)志賀菌207株，占77.8%,福氏志賀菌56株，占21.05%，鮑氏志賀菌1株(鮑氏4型),痢疾志賀菌2株(痢疾志賀菌2型和9型)。所有宋內(nèi)菌中宋內(nèi)I型181株，宋內(nèi)II型26株。福氏志賀菌株的分型情況如下：F1a 6株，F(xiàn)2a 36株，F(xiàn)1b 1株，F(xiàn)2b 4株，F(xiàn)4 2株，F(xiàn)4c 2株，F(xiàn)x 1株，F(xiàn)x變種2株，F(xiàn)y 1株，F(xiàn)y變種1株。

2.2藥物敏感性檢測結(jié)果 志賀菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明和萘啶酸三種藥物的耐藥率已經(jīng)超過90%，頭孢類藥物如頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢他啶以及環(huán)丙沙星的耐藥率低于20%，266株志賀菌全部敏感的藥物為亞胺培南。福氏志賀菌對環(huán)丙沙星、氯霉素和阿莫西林-克拉維甲酸的耐藥率較宋內(nèi)志賀菌高，宋內(nèi)志賀菌對磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明和慶大霉素的耐藥率較福氏志賀菌高 (表2)。

2.3產(chǎn)ESBLs菌株確證實(shí)驗(yàn) 按照CLSI推薦的頭孢噻肟、頭孢噻肟-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶-克拉維酸MIC法的確證實(shí)驗(yàn)，266株志賀菌中，95株志賀菌確證為產(chǎn)ESBL菌株。其中,19株為福氏志賀菌，76株為宋內(nèi)志賀菌。

2.4耐藥相關(guān)基因檢測 通過PCR方法檢測耐藥相關(guān)基因，結(jié)果顯示：95株21株檢出TEM基因(22.1%，21/95)，18株檢出OXA基因(18.95%，18/95)，75株檢出CTXM基因(78.95%，75/95)；75株CTXM陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)有1株CTXM3型；21株CTXM14型；53株CTXM15型。分析三種耐藥基因2013-2018年在產(chǎn)ESBLs菌株中的攜帶率，發(fā)現(xiàn)CTXM基因攜帶率一直處于較高水平，除2017年外，OXA和TEM基因的攜帶率一直較低(圖1)。

圖1 北京市2013-2018年產(chǎn)ESBLs志賀菌的三種耐藥相關(guān)基因攜帶率

3 討論

3.12008年以后，宋內(nèi)志賀菌已取代福氏志賀菌成為北京地區(qū)優(yōu)勢菌型[2]。監(jiān)測表明，2013-2018年宋內(nèi)志賀菌株依然是北京市優(yōu)勢菌株，并且志賀菌的耐藥情況日益突出。北京市志賀菌對氨芐西林、復(fù)方新諾明和萘啶酸三種藥物的耐藥率較高，臨床常用的頭孢曲松和頭孢噻肟的耐藥率也達(dá)到了40%以上，這個(gè)結(jié)果應(yīng)與臨床上常用這兩種藥物有關(guān)，其他學(xué)者也得到了相近的研究結(jié)果[7]。志賀菌對頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢他啶以及環(huán)丙沙星藥物的耐藥率比較低，可考慮用于臨床，但環(huán)丙沙星對于福氏志賀菌耐藥率較高，臨床應(yīng)用中應(yīng)予以關(guān)注。

表2 2013-2018年 北京市266株志賀菌藥物敏感性檢測結(jié)果

注：*為Fisher概率法計(jì)算得出的P值。

3.2研究結(jié)果顯示，266株志賀菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)確證試驗(yàn)，有95株志賀菌為產(chǎn)ESBLs菌株。ESBLs指能分解青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南等β-內(nèi)酰胺類抗生素的酶，其能夠使細(xì)菌對這類藥物產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致治療失敗[8,9]，因此，明確細(xì)菌是否產(chǎn)生ESBLs具有重要的臨床意義。對ESBLs特異相關(guān)基因的測序結(jié)果顯示，北京地區(qū)產(chǎn)ESBLs宋內(nèi)志賀氏菌以攜帶CTXM基因?yàn)橹?，主要為CTXM15型，其次為TEM型。以往的研究中，鮑春梅等[10]也得出相似結(jié)論，認(rèn)為北京市產(chǎn)ESBLs志賀菌株以CTXM型為主；浙江省和安徽省也報(bào)道檢出CTXM15型和CTXM14型ESBLs[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)CTXM基因2017年攜帶率出現(xiàn)降低，可能是由于該年份菌株量過少引起的異常結(jié)果。CTXM基因多由可接合的質(zhì)粒攜帶，更易于通過質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移方式傳播，所以對CTXM型ESBLS菌株的長期監(jiān)測具有很高的公共衛(wèi)生學(xué)意義，需要在日常工作中持續(xù)開展。