野生和栽培藍(lán)靛果中花色苷含量的測(cè)定及分析*

●齊會(huì)娟 劉德文 李中賓 張利軍 張春英 高 尊

（大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院 黑龍江 大興安嶺 165100）

藍(lán)靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.exHerd.）是忍冬科忍冬屬藍(lán)果忍冬的變種。漿果味道酸甜可口，可生食，又可提供色素，亦可釀酒、作飲料和果醬，富含維生素、有機(jī)酸、抗壞血酸、糖類，果實(shí)中還含有豐富的活性物質(zhì)，如單寧、花色苷、黃酮、皂苷等，具有降血壓、抗疲勞、保肝、心腦血管保護(hù)、抗菌、抗氧化、改善免疫功能、調(diào)節(jié)膽固醇等藥理作用[1,2]，有極高的藥用價(jià)值。據(jù)報(bào)道，藍(lán)靛果花色苷可降低乙醇對(duì)肝臟所造成的損傷[3]，藍(lán)靛果花色苷通過(guò)提高高脂血癥大鼠肝臟內(nèi)LXR、CYP7a1 m RNA表達(dá)，降低PPARmRNA表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，預(yù)防動(dòng)脈硬化的發(fā)生[4]，因此花色苷除了作為食用色素外，它還對(duì)人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的預(yù)防與治療有重要的意義[5]；藍(lán)靛果忍冬相較于其他植物含有更為豐富的花色苷，因而受到各國(guó)學(xué)者的高度重視[6]，但是藍(lán)靛果果實(shí)中有益于健康的活性物質(zhì)的含量與其生長(zhǎng)環(huán)境、地理位置密切相關(guān)，不同的生長(zhǎng)環(huán)境果實(shí)中的花色苷含量不同[7]。本文以大興安嶺地區(qū)同一資源圃中野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB為材料，采用pH示差法、O.D.法和高效液相色譜法對(duì)9 種漿果中的總花色苷進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行對(duì)比分析，擬為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用大興安嶺地區(qū)藍(lán)靛果漿果資源提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB（2018年6月20日采摘于大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)基地藍(lán)靛果資源圃），放置于 20℃冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）（美國(guó)Chromadex）；色譜純乙腈、甲醇（J＆K.SCITIFIC LTD.北京百靈威科技有限公司），色譜純甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 765 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（INESA），上海精密科學(xué)儀器有限公司；BA110S精密電子天平，Sartorius儀器(上海)有限公司；UP-30 純水機(jī)，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；沃特世e2695 高效液相色譜儀（Waters）；VOSHIN-1000DW超聲細(xì)胞破碎儀，無(wú)錫沃信儀器有限公司；DS-1 高速組織搗碎機(jī)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)靛果果實(shí)花色苷的提取 準(zhǔn)確稱取勻漿后的樣品5g于150mL燒杯中，加入95%的乙醇:1.5mol/L的鹽酸為85:15(體積比)的提取劑100mL，靜止30min后，超聲15min兩次，合并抽濾液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，濾渣加入30～40mL提取劑浸提3～4 次，過(guò)濾洗滌后用提取劑定容至250mL[8]。

1.2.2 O.D.法測(cè)定總花色苷含量 準(zhǔn)確移取1.2.1 中提取液稀釋25 倍后在波長(zhǎng)535nm處測(cè)定吸光值[8]，計(jì)算公式如下：

總花色苷含量 (mg/100g)=OD×DV×100×TEV/CrW×1/98.2

式中，OD為稀釋后溶液的吸光值；DV為稀釋倍數(shù)；TEV為提取液總體積；CrW為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 pH示差法測(cè)定總花色苷含量

1.2.3.1 緩沖液的配制。pH1.0 緩沖液：精密稱取1.49g氯化鉀，用蒸餾水定容至100mL，精密量取1.7mL鹽酸，用蒸餾水定容至100mL；將0.2mol/L氯化鉀與0.2mol/L鹽酸按體積比25:67 的比例混合，用氯化鉀溶液調(diào)節(jié)pH(1.0±0.1)。pH4.5 緩沖液:精密稱取1.64g乙酸鈉，用蒸餾水定容至100mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH(4.5±0.1)。

1.2.3.2 總花色苷含量測(cè)定方法。根據(jù)花色苷在pH1.0 時(shí)，在 520nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，而在pH4.5 時(shí)，花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色查爾酮形式，在520nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，所以可以利用pH示差法計(jì)算溶液中總花色苷的含量。準(zhǔn)確移取1.2.1 中的提取液樣品1mL 2 份，將pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的醋酸鈉緩沖溶液分別定容至10mL，放置2h，在520nm和700nm處分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算總花色苷含量(以矢車菊素-3-葡萄糖苷表示)[9]。計(jì)算公式如下:

總花色苷含量(mg/100g)=(A×V×n×M)/( ×m)×100

式中，A=pH 1.0－pH4.5；V為提取液總體積；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相對(duì)分子質(zhì)量 (449)；為Cy-3-Glu的消光系數(shù) (29 600)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 HPLC法測(cè)定總花色苷含量

1.2.4.1 色譜條件。色譜柱為島津C18 柱，4.6mm（內(nèi)徑）×250mm（長(zhǎng)）×5m（粒徑）?；ㄇ嗨兀òɑㄇ嗨剀蘸突ㄇ嗨剀赵┑臋z測(cè)波長(zhǎng)為525nm。流動(dòng)相組成為，A相：乙腈:甲醇=85:15；B相：10%甲酸水溶液。洗脫比例為：0min，8%A；15min，25%A；20min，8%A。柱溫35℃，流速0.8mL/min，進(jìn)樣體積10L，采用waters 2489 UV檢測(cè)器，用empower（3.0 版本）軟件分析[10]。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列。準(zhǔn)確稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品用2%的甲酸甲醇溶液定容稀釋至濃度為0.5mg/mL，分別稀釋至濃度為0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL。

1.2.4.3 樣品分析。取1.2.1 中提取液過(guò)0.45m濾膜后，按照1.2.4.1 中色譜條件進(jìn)樣。通過(guò)檢測(cè)出的總峰面積與已知標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品Cy3G的總花色苷含量和對(duì)應(yīng)的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有指標(biāo)均進(jìn)行了3 次平行樣測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

以5 個(gè)濃度系列為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到峰1 和峰2 對(duì)應(yīng)的兩個(gè)擬合方程如下:

兩個(gè)方程擬合系數(shù)R2均接近于1，適合用于各藍(lán)靛果樣品中對(duì)總花色苷含量和對(duì)應(yīng)的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量的計(jì)算。

圖中由上往下依次為野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果DN-2、BLY、DN-3、BL、EF、ED、RB、DN-1、矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)（Cy3G）譜圖。

圖2 不同品種藍(lán)靛果果實(shí)中花色苷高效液相色譜法定量譜圖對(duì)比

圖3 不同品種藍(lán)靛果果實(shí)中花色苷高效液相色譜法重疊譜圖

由圖2、圖3 可以看出9 種藍(lán)靛果果實(shí)中都有矢車菊-3-葡萄糖苷單體，各種果實(shí)的色譜圖中看出峰的個(gè)數(shù)不同，野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中峰的個(gè)數(shù)分別為 8、11、9、8、9、8、7、3、4，因此各種果實(shí)中花色苷種類不同。

2.2 藍(lán)靛果果實(shí)中總花色苷比較分析

見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)靛果果實(shí)中總花色苷比較分析

由表1 可以看出，采用O.D.法測(cè)定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序?yàn)镈N-1 ＞BLY＞BL＞EF＞DN-2 ＞DN-3 ＞野生藍(lán)靛果＞ED＞RB；采用pH示差法測(cè)定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序?yàn)镈N-1＞BLY＞BL＞EF＞DN-3 ＞DN-2 ＞野生藍(lán)靛果＞ED＞RB；采用HPLC法測(cè)定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序?yàn)镈N-1 ＞BLY＞DN-3 ＞野生藍(lán)靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；矢車菊-3-葡萄糖苷含量按照含量高低排序?yàn)镈N-1＞BLY＞DN-3 ＞野生藍(lán)靛果＞DN-2 ＞BL＞EF＞ED＞RB；其中矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占pH示差法測(cè)定總花色苷含量的96.44%、70.77%、72.32%、48.34%、73.90%、35.99%、33.47%、27.83%、30.23%，按照比率高低排序?yàn)橐吧{(lán)靛果＞DN-3 ＞DN-1 ＞BLY＞DN-2 ＞BL＞EF＞RB＞ED；矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占HPLC法測(cè)定總花色苷含量的 76.24%、68.86%、74.25%、73.08%、73.47%、73.63%、74.35%、71.06%、65.32%，按照比率高低排序?yàn)橐吧{(lán)靛果＞EF＞DN-1 ＞BL＞DN-3 ＞DN-2 ＞ED＞BLY＞RB。

同時(shí)采用3 種方法測(cè)定，栽培品種DN-1 每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最高分別為502.991mg、363.75mg，其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的72.32%，與其他8 種藍(lán)靛果相比差異極顯著；栽培品種RB每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最低分別為 118.109mg、35.70mg，其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的30.23%。因此栽培品種DN-1 從花色苷含量角度來(lái)看有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，野生藍(lán)靛果居中，而RB營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低。

圖4 藍(lán)靛果果實(shí)中不同方法測(cè)定花色苷含量對(duì)比

由圖4 可以看出，同一樣品用PH示差法測(cè)定藍(lán)靛果中總花色苷含量數(shù)值高于O.D.法測(cè)定結(jié)果，不同品種藍(lán)靛果中矢車菊-3-葡萄糖苷的含量各不相同，矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占pH示差法測(cè)定總花色苷含量的比率也各不相同，不成正比例關(guān)系；矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占HPLC法測(cè)定總花色苷含量的比率相近，最大差值為10.93%；根據(jù)HPLC總面積法測(cè)定野生藍(lán)靛果總花色苷含量高于PH示差法和O.D.法，測(cè)定栽培品種BLY、DN-1 和DN-3 中總花色苷含量與PH示差法基本一致，測(cè)定栽培品種DN-2、BL、EF、ED和RB中總花色苷含量均低于PH示差法和O.D.法，同時(shí)采用三種方法測(cè)定栽培品種ED和RB中總花色苷含量和矢車菊-3-葡萄糖苷單體含量都是最低的。EF、ED和RB中PH示差法和O.D.法測(cè)定總花色苷含量結(jié)果基本一致，均高于HPLC法；因此，O.D.法不適用于測(cè)定總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷含量高的果實(shí)。3 種方法測(cè)定結(jié)果的差異性可能與果實(shí)中色素和花色苷單體種類不同有關(guān)。

3 結(jié)論

大興安嶺地區(qū)每百克野生藍(lán)靛果中花色苷含量為273.25mg，高于伊春地區(qū)野生藍(lán)靛果的花色苷含量174.220mg[11]，大興安嶺地區(qū)栽培品種DN-1 中每百克花色苷含量為502.991mg，高于黑河栽培品種“加洛奇卡”花色苷含量322.64mg[12]，說(shuō)明大興安嶺地區(qū)特殊的地理位置有利于藍(lán)靛果樹(shù)種中活性物質(zhì)花色苷的積累；同時(shí)采用PH示差法、O.D.法和高效液相色譜法測(cè)定各品種之間總花色苷含量差異性顯著，花色苷含量豐富的果實(shí)宜采用PH示差法測(cè)定。栽培品種DN-1 中總花色苷含量最高，RB中總花色苷含量最低；為大興安嶺地區(qū)藍(lán)靛果的開(kāi)發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)支撐，而每個(gè)品種中花色苷的具體類型是需要再進(jìn)一步研究的課題。