流行性乙型腦炎患者腦脊液細(xì)胞學(xué)及生化特點(diǎn)

侯玉婷 王妍柏 何學(xué)仙 張春 吳若芬

流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B，以下簡(jiǎn)稱“乙腦”)是由嗜神經(jīng)的乙型腦炎病毒(encephalitis B virus)引起的一種腦實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng)為主的急性傳染病，蚊蟲(chóng)叮咬為主要傳播途徑[1]，夏秋季是乙腦易爆發(fā)的季節(jié)。據(jù)寧夏回族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心報(bào)道，與2017年寧夏回族自治區(qū)報(bào)告的2例乙腦相比，2018年乙腦病例數(shù)急劇增加，共報(bào)告163例，僅9月份就達(dá)85例。目前關(guān)于本地區(qū)乙腦患者腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)生化和細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)的研究較少。本研究對(duì)2018年作者醫(yī)院診治的乙腦患者的CSF細(xì)胞學(xué)及生化檢查結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析，旨在提高臨床對(duì)乙腦CSF細(xì)胞學(xué)及生化特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象回顧性收集2018-07-2018-09期間寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院確診的乙腦患者58例，其中男31例，女27例，年齡24～83歲，平均(58.2±13.8)歲。其中<40歲7例，40～60歲21例，>60歲30例?；颊哐搴?或)CSF乙腦特異性IgM抗體陽(yáng)性，并符合乙腦診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：(1)流行病學(xué)資料：明顯的季節(jié)性(夏秋季)，當(dāng)?shù)赜幸夷X流行；(2)臨床表現(xiàn)：起病急、高熱、頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙、抽搐、病理反射及腦膜刺激征陽(yáng)性；(3)外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例增高；(4)CSF檢查結(jié)果呈病毒性腦炎改變。排除病例：CSF呈非病毒性腦炎表現(xiàn)，或乙腦血清學(xué)檢測(cè)陰性，或能證實(shí)為其他疾病而排除乙腦診斷者。

1.2 方法

1.2.1臨床資料的收集：收集患者從發(fā)病至就診以及行腰椎穿刺的時(shí)間、CSF細(xì)胞學(xué)、CSF生化檢查資料，并分析不同病程時(shí)期CSF細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的變化。

1.2.2抗乙腦病毒IgM抗體檢測(cè)：所有患者行血液和CSF乙腦IgM抗體檢測(cè)，檢測(cè)單位為寧夏疾病預(yù)防控制中心。

1.2.3CSF細(xì)胞學(xué)檢查：行腰椎穿刺取CSF，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)CSF中的白細(xì)胞水平。隨后取0.5 mL CSF置于Cytospin-4型細(xì)胞玻片離心儀內(nèi)(Thermo Scientific)以113g離心5 min，制成CSF涂片。待涂片自然干燥后，將其置于水平位的染色架上，滴加邁-格-姬(MGG)染色液，然后加入緩沖液并吹勻，靜置5 min后流水沖洗。待干燥后采用CSF細(xì)胞圖像診斷分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞分類，共計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)和多個(gè)核細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)百分率[2-3]。根據(jù)CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果將炎性反應(yīng)程度分為4種[4]：(1)正常細(xì)胞學(xué)反應(yīng)：CSF白細(xì)胞數(shù)(0～10)×106/L，未見(jiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞以及激活的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)；(2)白細(xì)胞輕度增高：CSF白細(xì)胞數(shù)(10～50)×106/L，可見(jiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞；(3)白細(xì)胞中度增高：CSF白細(xì)胞數(shù)(50～200)×106/L，可見(jiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞；(4)白細(xì)胞重度增高：CSF白細(xì)胞數(shù)大于200×106/L，可見(jiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞。根據(jù)顯微鏡下CSF細(xì)胞學(xué)的表現(xiàn)，將炎性反應(yīng)類型分為：(1)淋巴細(xì)胞為主的炎性反應(yīng)；(2)中性粒細(xì)胞為主的炎性反應(yīng)；(3)淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞為主的炎性反應(yīng)；(4)淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞為主的炎性反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF細(xì)胞學(xué)檢查

2.1.1炎性反應(yīng)程度及類型：CSF白細(xì)胞中度增高者最多，為29例(50.0%)，重度增高者次之，為21例(36.2%)。腦脊液細(xì)胞學(xué)反應(yīng)類型以淋巴細(xì)胞炎性反應(yīng)為主最多，達(dá)31例(53.4%)，其次為以中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)為主，占27.6%。上述兩種CSF細(xì)胞學(xué)反應(yīng)類型中，均以CSF白細(xì)胞中度增高為主。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2CSF炎性細(xì)胞：9例患者(15.5%)CSF可見(jiàn)激活的淋巴細(xì)胞，11例(19.0%)可見(jiàn)激活的單核細(xì)胞，22例(37.9%)可見(jiàn)漿細(xì)胞(圖1)。

2.2 CSF生化檢查CSF蛋白(TP)水平為0.12～2.31 g/L，平均(0.91±0.40)g/L，其中正常者5例(8.6%)，升高者53例〔91.4%，(0.45～1.50)g/L者49例，>1.50 g/L者4例〕。CSF葡萄糖(Glu)水平為2.1～7.0 mmol/L，平均(3.38±0.93)mmol/L，其中正常者45例(77.6%)，降低者(<2.5 mmol/L)5例(8.6%)，升高者(>4.4 mmol/L)8例(13.8%)。CSF氯化物(Cl)水平為114～130 mmol/L，平均(120.62±3.69)mmol/L，其中正常者35例(60.3%)，降低者(<120 mmol/L)23例(39.7%)。CSF-TP升高者最多，為53例(91.4%)，其次為CSF-Cl水平降低(23例，39.7%)和CSF-Glu水平異常(13例，22.4%)。

2.3 CSF細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)變化因觀察病情需要，有29例乙腦患者進(jìn)行了CSF復(fù)查，共獲得87份CSF樣本，根據(jù)患者發(fā)病至檢測(cè)CSF的時(shí)間將CSF樣本檢測(cè)結(jié)果分為初期(發(fā)病1～3 d)、極期(發(fā)病4～10 d)和恢復(fù)期(發(fā)病第11 d以后)3組[4]。細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，初期31份CSF樣本以淋巴細(xì)胞炎性反應(yīng)為主和以中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)為主，混合細(xì)胞炎性反應(yīng)次之。極期以淋巴細(xì)胞炎性反應(yīng)為主。恢復(fù)期主要以淋巴細(xì)胞炎性反應(yīng)為主。具體結(jié)果見(jiàn)表2。不同時(shí)期CSF白細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，漿細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 58例乙腦患者CSF細(xì)胞學(xué)反應(yīng)類型及白細(xì)胞增高程度〔例(%)〕

注：乙腦：流行性乙型腦炎，CSF：腦脊液；圖1、表2～3同

A：以中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主(箭頭所示為激活的淋巴細(xì)胞)；B：以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞反應(yīng)為主(箭頭所示為激活的單核細(xì)胞)；C：以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主(箭頭所示為漿細(xì)胞) 圖1 乙腦患者CSF細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)(邁-格-姬染色，×1000)

病程份數(shù)淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主混合細(xì)胞反應(yīng)為主初期3112(38.7)12(38.7)7(22.6)極期3526(74.3)4(11.4)5(14.3)恢復(fù)期2120(95.2)0(0.0) 1(4.8) 合計(jì)8758(66.7)16(18.4)13(14.9)

表3 87份乙腦CSF樣本不同病程時(shí)期白細(xì)胞總數(shù)及炎性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)表〔中位數(shù)(四分位數(shù)間距)〕

3 討論

隨著疫苗的普及使用，兒童乙腦患者逐漸減少，但成人患者卻有逐漸增多趨勢(shì)[5]。本組患者以≥40歲居多，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[6]。

本研究結(jié)果顯示，乙腦患者CSF細(xì)胞學(xué)存在炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)程度以中、重度為主，少數(shù)患者為輕度；炎性反應(yīng)類型以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主，占53.4%，其次是中性粒細(xì)胞反應(yīng)和混合細(xì)胞型反應(yīng)，可見(jiàn)激活的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及漿細(xì)胞。

研究認(rèn)為，乙腦病毒可被巨噬細(xì)胞吞噬并進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。病毒感染后，神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)活躍，被激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的趨化蛋白-1(MCP-1)和不規(guī)則趨化因子參與調(diào)控白細(xì)胞遷移，吸引炎性細(xì)胞向炎性部位聚集[8]，故患者CSF中白細(xì)胞數(shù)量增加。此外，激活的單核細(xì)胞還參與組織修復(fù)及壞死組織的清除[8]，因此患者CSF中多見(jiàn)激活的單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)中重要的免疫細(xì)胞，被激活后參與抗原遞呈、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。Johnoson等[9]在乙型腦炎患者腦組織中檢測(cè)到T、B淋巴細(xì)胞，證實(shí)淋巴細(xì)胞參與乙型腦炎腦組織的免疫損傷。其中，CD4+T細(xì)胞對(duì)免疫的啟動(dòng)起到關(guān)鍵作用，導(dǎo)致炎性細(xì)胞的增加；CD8+T細(xì)胞可直接殺傷病毒感染的靶細(xì)胞。乙型腦炎病毒的包膜糖蛋白(E蛋白)是病毒侵襲過(guò)程中的關(guān)鍵因子，也是宿主免疫系統(tǒng)的主要攻擊靶點(diǎn)，能夠介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，故患者CSF中B淋巴細(xì)胞增多，活化為漿細(xì)胞并參與抗體合成[10]。這與本研究結(jié)果顯示乙腦患者CSF中淋巴細(xì)胞比例增高以及可見(jiàn)激活的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞的結(jié)果相一致。中性粒細(xì)胞通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11]，在宿主抗感染中起重要作用，作為效應(yīng)或殺傷細(xì)胞。本研究結(jié)果表明在乙型腦炎的初期、極期甚至是恢復(fù)期均可見(jiàn)一定比例的中性粒細(xì)胞，提示中性粒細(xì)胞在乙型腦炎免疫反應(yīng)中具有重要作用。本組患者中16例(27.6%)CSF細(xì)胞學(xué)以中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)為主，這與以往研究結(jié)果相一致[12-15]。

魯明等[13]研究結(jié)果顯示，乙型腦炎患者CSF細(xì)胞學(xué)在乙腦初期(發(fā)病1～3 d)以中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主，極期(發(fā)病4～10 d)中性粒細(xì)胞比例下降，出現(xiàn)混合細(xì)胞反應(yīng)為主，恢復(fù)期中性粒細(xì)胞比例迅速下降甚至消失，CSF細(xì)胞學(xué)以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主。本研究顯示，乙腦初期、極期以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主的比例較高，其原因可能與研究對(duì)象不同有關(guān)，本文研究對(duì)象為成年人，相對(duì)于兒童患者免疫力強(qiáng)，恢復(fù)快，中性粒細(xì)胞下降及淋巴細(xì)胞升高的速度也較快。經(jīng)臨床治療以及隨著病程的推移，乙腦患者CSF白細(xì)胞總數(shù)不斷下降，中性粒細(xì)胞比例和單核細(xì)胞比例下降明顯，淋巴細(xì)胞比例顯著升高，至恢復(fù)期，中性粒細(xì)胞比例下降或消失，并以淋巴細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量單核細(xì)胞及漿細(xì)胞。本研究上述乙腦各病期白細(xì)胞總數(shù)和炎性細(xì)胞比例的變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)[3]、[14]報(bào)道相符，表明乙腦患者中性粒細(xì)胞持續(xù)時(shí)間較一般病毒性腦炎長(zhǎng)，在乙腦恢復(fù)期(11 d以后)還有少量比例的中性粒細(xì)胞。

國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，CSF-TP是評(píng)估CSF免疫反應(yīng)的生化指標(biāo)之一，可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)與神經(jīng)免疫反應(yīng)的程度[16]。本研究中53例(91.4%)患者CSF-TP水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12，15]。CSF-TP水平升高表明神經(jīng)系統(tǒng)存在炎性反應(yīng)，提示乙腦患者血-腦屏障(BBB)破壞，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，致使血清蛋白滲透入CSF，進(jìn)而CSF-TP升高。53例(91.4%)患者CSF-Glu正常或偏高，符合乙腦的生化改變特點(diǎn)[12，15]。僅有5例(8.6%)患者CSF-Glu下降，可能是乙腦病毒引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝改變，或細(xì)胞代謝產(chǎn)物抑制細(xì)胞膜攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)功能，導(dǎo)致Glu由血液進(jìn)入CSF的運(yùn)輸發(fā)生阻礙[4]。本組患者CSF-Cl可偏低或正常，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12，15]。

綜上所述，乙腦患者CSF白細(xì)胞數(shù)升高，各病期炎性細(xì)胞所占比例不同，中性粒細(xì)胞持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，蛋白多升高。上述CSF細(xì)胞學(xué)及CSF生化檢查結(jié)果特點(diǎn)可為臨床診療提供一定參考。