液基細胞學技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值

孫逸敏 王振清 賈佳 谷化平

早期診斷和及時治療在結(jié)核病防治中起關(guān)鍵作用，而提高診斷技術(shù)的檢出率是早期發(fā)現(xiàn)患者的核心[1]。分枝桿菌涂片鏡檢作為最早的結(jié)核病實驗室檢查手段，目前仍是結(jié)核病檢驗方法學的基礎(chǔ)，具有快速、方便、價廉的優(yōu)勢，對判斷患者的傳染性具有重要意義，但其陽性檢出率較低[2]。液基細胞學技術(shù)(thinprep cytologic test，TCT)是一種將脫落細胞保存在液體中，通過機械、氣動與流體力學原理，采用全自動設(shè)備將脫落細胞均勻分散地貼附于載玻片上的最優(yōu)質(zhì)、惟一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證的薄層制片技術(shù)，可大大減少阻礙視線的血液、黏液和炎細胞的數(shù)量，主要應(yīng)用于宮頸、體腔積液、尿液、肛管直腸脫落細胞的檢查[1]，對提高癌前病變檢出率有重要意義；但目前用于檢測結(jié)核分枝桿菌的報道較少[1]。筆者采用TCT檢測初診為疑似肺結(jié)核患者的不同類型標本(包括痰液、胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標本)中分枝桿菌的陽性檢出率及檢測效能，為TCT的應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

搜集2017年11月至2019年2月河北省張家口市傳染病醫(yī)院診治的符合納入標準的248例初診為疑似肺結(jié)核的患者。其中男133例(53.63%)，女115例(46.37%)；年齡12～85歲，平均(43.52±19.73)歲。由結(jié)核科醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)臨床表現(xiàn)及體征按照每例患者選用1種類型臨床標本的原則共采集248份臨床標本，包括101份晨痰標本(具有咳嗽、咳痰≥2周等呼吸道癥狀，或痰中帶血或咯血)、67份胸腔積液標本(胸部CT平掃檢查提示肺內(nèi)浸潤性病變伴胸腔積液)、80份支氣管肺泡灌洗液標本(不明原因慢性持續(xù)性咳嗽、咳痰、喘鳴、聲嘶及呼喚困難，痰標本抗酸桿菌陽性而肺部CT平掃未發(fā)現(xiàn)結(jié)核病灶)。最終通過臨床綜合診斷確診為肺結(jié)核患者181例，非肺結(jié)核患者67例[包括肺炎43例、慢性阻塞性肺疾病(COPD)7例、支氣管擴張8例、肺癌7例、未明確病因2例]。

所有入選患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準；均行胸部CT平掃檢查，提示肺內(nèi)浸潤性病變，考慮肺結(jié)核可能性大；均符合《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]標準，依據(jù)患者臨床癥狀、體征、X線攝影檢查、實驗室檢查、臨床試驗性抗結(jié)核藥物治療等臨床綜合診斷確診；均未進行隨訪和使用抗結(jié)核藥物治療。

二、 檢測技術(shù)與方法

對臨床送檢的每份痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標本同時進行萋-尼抗酸染色涂片法鏡檢(Ziehl-Neelsen 染色涂片法鏡檢，簡稱“Z-N涂片法”)、TCT和BACTECTMMGIT 960分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)(簡稱“MGIT 960法”)檢測。

1.Z-N涂片法：(1)痰標本直接按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]行Z-N染色涂片鏡檢(油鏡 ×100)，可見細胞重疊，厚薄不均，紅色為抗酸桿菌，藍色為細胞碎片及黏液、纖維蛋白成分，染色結(jié)構(gòu)模糊，整個視野僅偶見1小束分枝桿菌，記錄鏡檢結(jié)果；(2)胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液標本首先靜置2～4 h，再取20～50 ml沉淀物經(jīng)3000×g離心20～30 min后，取離心后沉淀物1 ml參照文獻[4]進行涂片、Z-N抗酸染色、鏡檢，記錄結(jié)果。

2.TCT：(1)于生物安全柜中將痰標本加入至專用細胞保存液中靜置15 min，若黏液較多則在痰標本中加入2～3 ml痰消化液(NALC-NaOH混合液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；處理(具體方法依據(jù)珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供的使用說明書)后震蕩3 min進行液化，3000×g離心 5 min，棄上清液，取1 ml濃縮樣本加入制片夾中，置于配套制片機內(nèi)1500×g離心2 min；采用95%乙醇固定15 min后制片，再烘干玻片、Z-N抗酸染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡檢(油鏡 ×100)可見背景清晰干凈，細菌均勻分布在載玻片上，且形態(tài)和結(jié)構(gòu)保存良好，涂片未見血液、黏稠膿液、纖維蛋白成分，標本整個視野均是染色為紅色的分枝桿菌，記錄結(jié)果；(2)胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液均取50 ml送檢標本，3000×g離心5 min，棄上清液，如有黏液加入等量NALC-NaOH消化液，取1 ml濃縮樣本加入專用制片夾，余下制片步驟同痰標本，上鏡觀察，記錄結(jié)果。

3. MGIT 960法：248份標本均按照MGIT 960全自動分枝桿菌液基檢測系統(tǒng)(購自美國BD公司)說明書的規(guī)定進行檢測。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，以臨床診斷為標準計算Z-N涂片法、TCT、MGIT 960法的檢測效能。3種檢測方法計數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。注：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

結(jié) 果

一、3種方法檢測不同類型標本中分枝桿菌陽性率的比較

248份痰培養(yǎng)標本中，MGIT 960法檢測的陽性標本為155份，包括晨痰82份、胸腔積液17份、支氣管肺泡灌洗液56份。TCT檢測總標本、痰液標本、胸腔積液標本、支氣管肺泡灌洗液標本中分枝桿菌的陽性率(分別為53.63%、67.33%、17.91%、66.25%)均明顯高于Z-N染色法(分別為25.81%、36.63%、7.46%、27.50%)(χ2=46.788，P=0.000；χ2=19.736，P=0.000；χ2=9.449，P=0.002；χ2=20.833，P=0.000)。但TCT檢測痰標本的陽性率明顯低于MGIT 960法，而胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標本的檢測結(jié)果相比較與MGIT 960法差異均無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

二、 TCT和Z-N染色法檢測不同類型培養(yǎng)陽性標本中分枝桿菌陽性率的情況

TCT檢測培養(yǎng)陽性的痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標本中分枝桿菌的陽性率明顯高于Z-N染色法(P值均<0.05)，詳見表2。

三、3種方法對不同類型臨床標本的檢測效能

以臨床診斷為參考標準，TCT檢測所有臨床標本的敏感度[72.93%(132/181)]和一致率[79.84%(198/248)]均明顯高于Z-N染色法[分別為30.39%(55/181)、48.79%(121/248)]，但明顯低于MGIT 960法[分別為85.64%(155/181)、89.52%(222/248)]。三者特異度接近[分別為98.51%(66/67)、98.51%(66/67)、100.00%(67/67)]，詳見表3。

表1 不同類型標本采用3種方法檢測的分枝桿菌陽性率比較

注括號外數(shù)值為“標本份數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”；a：為TCT與MGIT 960法檢測陽性率的比較；b：為Z-N染色法與MGIT 960法檢測陽性率的比較

表2 不同類型培養(yǎng)陽性標本采用TCT和Z-N染色法檢測的分枝桿菌陽性率比較

注括號外數(shù)值為“標本份數(shù)”，括號內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”

表3 以臨床診斷為參考標準評價3種方法的檢測效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

討 論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的全身多系統(tǒng)疾病，以肺結(jié)核多見[5]，是嚴重危害人類健康的全球性呼吸系統(tǒng)傳染病[6]。早期準確診斷是結(jié)核病患者得以及時治療的關(guān)鍵，而提高診斷技術(shù)對早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者至關(guān)重要。我國基層結(jié)核病實驗室承擔著主要的肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)工作，但對肺結(jié)核患者的檢測手段極其有限，盡管結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)仍是結(jié)核病診斷的“金標準”[7]，敏感度較高，但獲得結(jié)果的時間較長(2～6周)[8]，不利于及時發(fā)現(xiàn)和治療患者[9]。因此，基于傳統(tǒng)涂片法(標本涂片染色后顯微鏡下形態(tài)學檢查)簡單、快速、成本低的優(yōu)勢[10]，目前仍是基層結(jié)核病實驗室廣泛使用的結(jié)核病診斷技術(shù)[11-13]。但由于傳統(tǒng)涂片法是手工將體液沉淀物推涂在玻片上，厚薄不一，難以去除細胞碎片、血液、黏液等成分，導致視野模糊不清，且當分枝桿菌菌量偏少時也難以通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，導致其敏感度和特異度不高[8]；加之涂片技術(shù)存在盲目取材、標本利用率不高，涂片過大、過厚，存在大量的紅細胞、黏液，導致觀察者視覺疲勞，干擾診斷。為提高傳統(tǒng)涂片法的敏感度，研究者不斷對其進行優(yōu)化[14]。

TCT是近年來應(yīng)用于臨床細胞病理學診斷的一種新技術(shù)，其優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法的特點如下：(1)具有標本保存功能。采用專用細胞保存液對標本進行解黏、消化處理，可保證標本新鮮完好，且去除了標本中的黏液、細胞碎片、纖維蛋白、膿液等的干擾，使背景清晰干凈，細胞及細菌均勻分布在載玻片上，且形態(tài)和結(jié)構(gòu)保存良好；(2)標本利用率高。該技術(shù)對保存在液基瓶內(nèi)的標本可以制作多張涂片，符合不丟棄任何所選材料的原則[12]。對同一標本也可以進行多項檢查，如目前廣泛應(yīng)用的細胞病理學檢測、細胞免疫化學、以及分子生物學檢測等，可以滿足臨床診斷需要，是TCT的顯著特點；(3)涂片技術(shù)進一步改進。由于無人為的涂抹、牽拉、擠壓，且通過配套制片機甩片，涂片無血液、黏稠膿液、纖維蛋白成分，可將細胞、細菌均勻地分布在載玻片上，無重疊、損傷、變形；并因除去了標本中的黏液、細胞碎片、纖維蛋白、膿液等的干擾，使背景清晰干凈，易于觀察鑒別，可最大限度提取標本制片，增加細菌呈現(xiàn)量[11]，在保證原有染色性能的基礎(chǔ)上，明顯提高了涂片質(zhì)量、陽性檢出率和診斷能力；(4)涂片標準化。TCT可使分枝桿菌染色涂片達到標準化，降低了因在涂片和染色過程中不按程序規(guī)范操作導致的結(jié)果差異，可作為滿足室內(nèi)及室間質(zhì)量控制的需要和患者診斷回顧性分析的依據(jù)[13]。但值得注意是，TCT在檢測痰標本時，需對標本進行前處理、離心沉淀、專用制片機甩片，致其成本支出增高、檢測耗時較長，對于痰標本檢測量大的實驗室，可能會影響閱片效率和檢驗費用，需綜合考慮其應(yīng)用價值；但對于胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液標本則不存在這些問題，其操作仍較傳統(tǒng)方法簡便、快速，陽性檢出率高，有利于臨床快速準確診斷。

本研究結(jié)果顯示，TCT無論用于所有疑似肺結(jié)核標本還是分枝桿菌培養(yǎng)陽性標本，其檢測痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液標本的陽性率均明顯高于Z-N染色法，尤其可明顯提高涂片抗酸染色“++”以下標本的陽性檢出率，且檢測支氣管肺泡灌洗液標本的陽性率更為明顯。由于涂陰肺結(jié)核患者常少痰甚至無痰，不合格的痰標本可明顯影響其檢測結(jié)果，而支氣管肺泡灌洗液直接取材于病變部位，加之纖維支氣管鏡檢查的“激惹”作用和沖洗，可明顯增加獲得分枝桿菌的機會，因此對于痰菌含量少(無痰或少痰)或菌陰者、肺部病灶局限、與引流支氣管不相通、肺結(jié)核病灶暫時穩(wěn)定的患者，可采集支氣管肺泡灌洗液檢測[15-17]。

本研究以臨床診斷為標準，應(yīng)用TCT、Z-N染色法、MGIT 960法三種方法檢測不同類型臨床標本中的分枝桿菌，TCT檢測的敏感度、一致率明顯高于Z-N染色法，但低于MGIT 960法，與相關(guān)報道結(jié)果相似[2]。進一步說明盡管目前Z-N染色法仍是基層醫(yī)院發(fā)現(xiàn)分枝桿菌的重要手段，但直接涂片法的標本質(zhì)量差，直接影響到涂片的制片、染色效果，從而降低分枝桿菌的陽性檢出率和敏感度[18]；而TCT可以有效減少操作人員的操作誤差，實現(xiàn)涂片的標準化和最大化有效利用標本，特別是對于荷菌量少的標本，可明顯提高分枝桿菌的陽性檢出率和敏感度，且陽性率與MGIT 960法相當。

近年來，一些新的技術(shù)如分子生物學技術(shù)開始應(yīng)用于病理學診斷[19]，如通過檢測病理標本中結(jié)核分枝桿菌及其DNA來進行結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病的鑒別，或通過檢測標本中結(jié)核分枝桿菌的抗原或抗體進行診斷等[20-21]。這些技術(shù)在一定程度上提高了結(jié)核病病理學診斷的準確率，為病理學的發(fā)展提供了新方向，但由于分子生物學技術(shù)費用較高，且對實驗室環(huán)境及工作人員水平要求也高，在基層醫(yī)院難以開展[22]。而TCT從標本收集、保存、制片、診斷等方面均較傳統(tǒng)涂片法有了重大改進和提高，尤其在檢測不同類型體液標本時，其操作簡單、快速，陽性率高，易于臨床推廣，更適用于基層單位，對肺結(jié)核快速準確診斷具有重要的臨床應(yīng)用價值。