不同消毒劑對規(guī)?；B(yǎng)羊場舍內(nèi)空氣細菌的影響

鐘純燕　郝飛　李文良　毛立　主性　嵇辛勤　江杰元　李基棕　劉茂軍

摘要：為篩選出最佳消毒劑以降低羊舍內(nèi)空氣細菌含量，采用規(guī)模養(yǎng)羊場常用的4種消毒劑進行消毒效果試驗，在消毒前后測定羊舍內(nèi)空氣中細菌總數(shù)，并對優(yōu)勢菌落進行PCR鑒定。結果顯示，不同種類的消毒劑殺菌效果有差異，其中戊二醛溶液的殺菌率為42.8%，戊二醛癸甲溴銨溶液殺菌率為58.6%，溴氯海因殺菌率為76.5%，聚維酮碘殺菌率為44.5%，因此溴氯海因殺菌效果最佳;PCR擴增測序結果表明，羊舍內(nèi)空氣細菌主要有芽孢桿菌、葡萄球菌、志賀氏菌、不動桿菌、奧斯陸莫拉菌、希氏腸球菌和胚芽乳桿菌等，這些細菌的16S rRNA序列與GenBank收錄的參考序列同源性達98.0%以上。本研究為規(guī)模養(yǎng)羊場細菌性疾病的預防與控制提供參考數(shù)據(jù)。

關鍵詞：規(guī)?；B(yǎng)羊場;消毒劑;細菌計數(shù);PCR鑒定

中圖分類號： S826.4+6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0194-04

近年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，羊群數(shù)量不斷增加，規(guī)?；B(yǎng)羊場逐漸形成。規(guī)?；B(yǎng)殖雖然降低了經(jīng)濟成本，但也因為患畜的頻繁接觸、羊舍通風不良、排泄物堆積等因素導致空氣中細菌濃度大大升高，這對羊群健康產(chǎn)生潛在的威脅[1-2]。王振對發(fā)病羊的病料進行細菌流行病學調查發(fā)現(xiàn)，主要病原菌有鏈球菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和溶血性曼氏桿菌，動物試驗結果顯示這些細菌對小白鼠致病力較強[3]。李奕芙研究得出，羊場發(fā)病死羊以綠膿桿菌的感染率最高（49.3%），且存在細菌多重感染，其中二重感染率達54.4%[4]。因此，掌握養(yǎng)羊場空氣中的細菌數(shù)量和種類，是預防和控制養(yǎng)羊場細菌性疾病的先決條件。規(guī)模羊場常用噴霧消毒來殺滅羊舍內(nèi)細菌，但市面上用于羊場細菌消毒的消毒劑種類較多，消毒效果也存在一定差異，選擇敏感性消毒劑做好環(huán)境消毒亦成為當前凈化環(huán)境、控制疾病的主要手段[5-6]。

因此，為準確掌握各種消毒劑的殺菌效果，本試驗采用噴霧消毒法對規(guī)模羊場常用的4種消毒劑進行消毒效果評估，計算消毒后的殺菌率，選擇最有效合理的消毒劑，并鑒定其中的優(yōu)勢菌落，以期為消毒劑的選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1培養(yǎng)基及試劑

綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker等均購自北京全氏金生物技術有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2消毒藥品

試驗使用了4種消毒劑，分別為稀戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液、溴氯海因粉和聚維酮碘溶液（表1）。[HJ1.5mm]

1.2試驗時間與地點

本試驗于2017年11月在江蘇省太倉市某湖羊場進行。

1.3采樣設計

選擇4間羊數(shù)、大小、風向相同的羊舍，在每間羊舍內(nèi)設置6個細菌采集點，1個采集點放置2個綿羊鮮血瓊脂平皿，每間羊舍中間設有過道，分別在過道三等分處按圖1所示設置6個采集點。

1.4試驗方法

1.4.1空氣中細菌總數(shù)測定

參照中華人民共和國國家標準GB/T 18024.1—2000《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數(shù)測定》收集羊舍內(nèi)空氣中的細菌[7]。消毒前后1 h對空氣中的細菌進行收集，將綿羊鮮血瓊脂平皿開蓋放置于羊舍內(nèi)離地面1.5 m的6個采集點上，暴露于空氣中10 min后，蓋好平皿蓋，標注采集地點、日期及編號，冷藏快速送往實驗室置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。對平皿上的細菌菌落進行計數(shù)，以每平皿菌落數(shù)（CFU/m3）報告結果。

1.4.2消毒劑殺菌試驗

將戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液、溴氯海因、聚維酮碘4種消毒劑按說明書上的最適殺菌濃度進行稀釋，每種消毒液噴灑消毒1間羊舍，消毒后1 h，利用自然沉降法收集羊舍內(nèi)空氣中的細菌，進行平板計數(shù)，計算消毒后的細菌含量和殺菌率[8]。殺菌率=（消毒前菌數(shù)-消毒后菌數(shù)）/消毒前菌數(shù)×100%，從6個細菌采集點的殺菌率求出每種消毒劑的平均殺菌率。

1.4.3優(yōu)勢細菌鑒定

參照丁燕霞等設計的細菌16S rRNA引物[9]（P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，預期擴增片段大小約為1 400 bp。選取優(yōu)勢菌落制備細菌染色體DNA模板，PCR反應體系為25.0 μL：Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DNA模板2.0 μL，引物P1、P2各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，無菌水17.0 μL。反應程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應結束后，取PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。將目的片段切膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)鑒定正確后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

2結果與分析

2.1羊場舍內(nèi)空氣細菌菌落總數(shù)

羊舍內(nèi)空氣中采集到的細菌經(jīng)過夜培養(yǎng)后，按奧氏公式[10]計算菌落總數(shù)：C=50 000N/AT。C表示菌落總數(shù)，CFU/m3;N表示每皿菌落數(shù)，個;A表示培養(yǎng)皿面積，cm2;T表示采樣時間，min。所得菌落總數(shù)見表2。

2.2消毒劑殺菌試驗

對4間羊舍分別使用4種消毒劑進行噴灑消毒，因消毒劑的種類不同，消毒效果也不同，4種消毒劑的殺菌率見表3，其中以溴氯海因殺菌效果最好。

2.3優(yōu)勢細菌鑒定

2.3.1PCR鑒定結果

將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，得到大小約1 400 bp的特異性條帶，與預期結果一致（圖2）。測序獲取核酸序列，BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，主要優(yōu)勢菌包括芽孢桿菌屬（枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、土地芽孢桿菌和類芽孢桿菌）、葡萄球菌屬（產(chǎn)色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和金黃色葡萄球菌）、不動桿菌屬（不動桿菌和魯氏不動桿菌）、腸球菌（希氏腸球菌和屎腸球菌）、痢疾志賀氏菌、大腸桿菌、奧斯陸莫拉菌、胚芽乳桿菌等。

2.3.2遺傳進化分析

將獲取的核酸序列經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀氏菌、奧斯陸莫拉菌、不動桿菌、屎腸球菌、胚芽乳桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌與GenBank中收錄的菌株16S rRNA同源性均達98%以上。用MEGA 5.0繪制遺傳進化樹得出，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、不動桿菌、胚芽乳桿菌和奧斯陸莫拉菌與GenBank中的參考序列遺傳距離均較遠;痢疾志賀氏菌與HQ759185.1、KY789442、EU009185.1、KX162657.1等11株菌序列親緣關系最近;屎腸球菌與KT261031.1、KT261082.1親緣關系最近;枯草芽孢桿菌與CP024649、CP017682、AP018349.1、AP017891.1親緣關系最近，共同組成一組微小分支（圖3）。

3討論與結論

規(guī)?；B(yǎng)羊場疫病往往是在多種因素誘導下發(fā)生的，包括外界病原菌入侵或動物機體內(nèi)細菌增殖紊亂等因素造成[11]。因此，對羊舍空氣進行消毒是減少環(huán)境中的病原菌、消滅傳染源、預防和控制羊群疾病的發(fā)生的重要措施。目前，消毒劑的種類繁多，消毒效果各異，在實際使用過程中存在選擇不當造成效果不佳、疫病控制不力等問題。本試驗對消毒劑殺菌能力進行比較分析，可篩選適用于規(guī)?；B(yǎng)羊場消毒使用的消毒劑。結果表明，通過測定消毒前后羊舍內(nèi)空氣細菌數(shù)量，4種消毒劑均有較好的消毒效果，其中溴氯海因殺菌效果最佳，殺菌率能達到76.5%，戊二醛癸甲溴銨次之，殺菌率為 58.6%，戊二醛殺菌率為42.8%，聚維酮碘消毒能力最弱，殺菌率為44.5%。鹵素類消毒劑的殺菌效果具有廣譜、高效、廉價等特點，是當前養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的消毒劑，其中氯的殺菌力最強，對皮膚和黏膜有刺激作用，廣用于飲水消毒和廄舍、場地、車輛、排泄物等的消毒;碘殺菌能力稍弱，刺激性較小，一般用于皮膚消毒和創(chuàng)面消毒[12-13]。本研究使用的溴氯海因溶于水后可形成次溴酸和次氯酸，推測混合型消毒劑的消毒效果較好;多重組分的消毒劑戊二醛癸甲溴銨的殺菌效果也強于單一組份的消毒劑戊二醛。

空氣中的致病菌可能通過微生物氣溶膠的形式污染飲水槽或進入羊呼吸道引起感染，甚至污染羊場周圍環(huán)境，威脅公共衛(wèi)生安全[14]。本試驗通過對優(yōu)勢菌落進行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，該羊場存在一定數(shù)量的致病菌，其中痢疾志賀氏菌可感染幼羊導致腹瀉，從而引起大批發(fā)病和死亡;金黃色葡萄球菌常引發(fā)滲出性皮炎、乳房炎、拉稀、關節(jié)腫大和膿腫等，說明獸醫(yī)人員應制定健全的衛(wèi)生管理制度，做好環(huán)境消毒和免疫接種[15]。大腸桿菌是危害養(yǎng)羊生產(chǎn)的常見條件致病菌，在臨床檢測中分離率較高，耐藥性也較強[16-17]。惠艷華等、陸桂平等和王磊等在上海、江蘇和青海地區(qū)均檢測到大腸桿菌病的發(fā)生[18-20]。顏艾等對貴州省發(fā)病羊進行細菌檢測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染率較高，且檢出大腸桿菌和支原體混合感染[21]。本試驗羊場的空氣中存在大腸桿菌，推測該細菌來源于羊群糞便和污水，因此羊場工作人員應加強糞便和污水的清理及無害化處理，防止大腸桿菌病的發(fā)生。本試驗在羊舍空氣中檢測到枯草芽孢桿菌和屎腸球菌，近期研究表明這些細菌可作為日糧添加以提高動物的生長性能[22-23]，但其在羊舍空氣環(huán)境中存在是否會對羊群健康造成影響，有待進一步探究。

以上結果表明，規(guī)模養(yǎng)羊場羊舍空氣中細菌含量較高，種類繁多，且存在一些致病菌和條件致病菌。4種常見消毒劑殺菌效果均較好，其中以溴氯海因的消毒能力最佳，可在規(guī)模羊場推廣應用。

參考文獻：

[1]王磊. 冬季舍飼密度對羊舍環(huán)境及肉羊生產(chǎn)性能影響的研究[D]. 石河子：石河子大學，2015.

[2]Wilson-Welder J H，Nally J E，Alt D P，et al. Experimental transmission of bovine digital dermatitis to sheep：development of an infection model[J]. Veterinary Pathology，2017（5）：1-13.

[3]王振. 規(guī)?；驁黾毦〉牧餍胁W調查及細菌性病原的分離鑒定和系統(tǒng)進化分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2015.

[4]李奕芙. 規(guī)模化羊場細菌多重感染的病原分析與生物安全體系的實施[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2014.

[5]Mitsui T，Harasawa R. The effects of essential oil，povidone-iodine，and chlorhexidine mouthwash on salivary nitrate/nitrite and nitrate-reducing bacteria[J]. Journal of Oral Science，2017，59（4）：597-601.

[6]熊云梅. 牛、羊場環(huán)境中氣載需氧菌及金黃色葡萄球菌的檢測與散播研究[D]. 晉中：山西農(nóng)業(yè)大學，2016.

[7]公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數(shù)測定：GB/T 18204.1—2000[S].

[8]伍清林，金蘭梅，張玉紅，等. 豬舍環(huán)境中細菌總數(shù)測定和消毒劑對致病菌的敏感性試驗[J]. 金陵科技學院學報，2012，28（4）：71-78.

[9]丁燕霞. 市售鮮肉中細菌污染的安全評價和耐藥性分析[D]. 長春：吉林大學，2015.[HJ1.78mm]

[10]李基棕，高穎，杜海燕，等. 規(guī)?；B(yǎng)豬場環(huán)境細菌的調查與分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（8）：199-203.

[11]Windsor P A. Paratuberculosis in sheep and goats[J]. Veterinary Microbiology，2015，181（1/2，SI）：161-169.

[12]劉春燕. 含氯消毒劑的研究進展[J]. 中國家禽，2004，26（10）：51-52.

[13]陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[14]唐芳，高靜，靳玉舒，等. 山西省某舍飼羊場環(huán)境微生物的檢測與分析[C]. 中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第二十一次學術研討會暨中國病理生理學會動物病理生理學專業(yè)委員會第二十次學術研討會論文集，2015.

[15]李基棕，周碧君，王開功，等. 貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場主要病原菌的耐藥性檢測[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（8）：132-135.

[16]夏利寧，向發(fā)，羅小魚，等. 新疆某羊場分離的大腸桿菌對抗生素耐藥性調查[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學，2014，51（1）：150-156.

[17]Nielsen J N，Patterson J A. The presence and prevalence of salmonella，campylobacter spp and o-serotypes of E.coli in swine raised under differing management schemes[J]. Ietock Man，1996，95（5）：143-148.

[18]惠艷華，葉慧萍，付貴香. 一例羊大腸桿菌病的診治[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013（3）：63.

[19]陸桂平，王海燕. 一例羊大腸桿菌性腹瀉的診斷和防控建議[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2014（2）：118-120.

[20]王磊，董海宏，乜志剛. 一起羊大腸桿菌病的診治報告[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2017（4）：80.

[21]顏艾，王開功，文明，等. 羊場主要流行疫病調查[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（12）：191-194.

[22]鄧軍，李云鋒，楊倩. 枯草芽孢桿菌和豬源乳酸桿菌混合飼喂對仔豬腸絨毛發(fā)育的影響[J]. 畜禽業(yè)，2013，44（6）：27.

[23]文靜，孫建安，周緒霞，等. 屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2011，23（1）：70-73.